[发明专利]猪流行性腹泻病毒的生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种应用生物反应器微载体细胞培养技术生产疫苗的方法，可用于工业化生产猪流行腹泻疫苗，替代传统的转瓶培养法生产工艺。

背景技术

目前，国内猪流行性腹泻疫苗生产唯一依靠细胞转瓶培养法实现。该传统工艺劳动强度大，耗时长、效率低，生产成本高；容易被环境污染；不同生产批次间或同一生产批次不同瓶间的差异大；难以扩大生产；容易出现被细菌或其它病毒污染而致的疫苗质量隐患，涉及生物安全和公共卫生问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有细胞转瓶培养法技术存在的不足之处，提供一种应用生物反应器微载体细胞培养高效生产猪流行性腹泻疫苗的方法。该方法可以大量降低生产成本，而且生产周期短，占用场地小，易于快速扩大生产规模，环境污染少且易于处理，自动化程度高，用人少，质量易于实现均衡稳定。可显著提高猪流行性腹泻病毒的单位效价以及疫苗产量和质量。

为达到上述目的，本发明采取了如下的技术方案：

一种猪流行性腹泻病毒的生产方法，包括如下步骤：

(1)制苗用细胞的传代与培养：取VERO细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以“细胞生长液”培养，培养温度为35-38℃；形成良好细胞单层时，用于继续传代或接种于生物反应器中进行微载体悬浮培养；

(2)细胞毒种的繁殖：用“病毒培养液”将猪流行腹泻病毒种毒按0.5-5％比例接种到步骤(1)形成的良好细胞单层继续培养，至细胞50-100％以上病变时收获病毒液；再将此病毒液作为种毒，在细胞上进行细胞适应性连续传代复壮，每次传代产物进行病毒TCID₅₀和无菌检测，传至病毒TCID₅₀稳定且达到10^7.0TCID₅₀/mL以上时停止复壮，作为生产种子；

(3)VERO细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养：生物反应器按总体积的30％-80％加入无菌“细胞生长液”，且每升无菌细胞生长液中按3-10g/L浓度加入微载体，启动生物反应器，低转速搅拌30分钟后，取步骤(1)转瓶上生长良好的VERO细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化制备为细胞悬液，细胞计数后按按1～3×10⁵个/mL的密度接种到反应器中，设定适合的温度、PH、搅拌速度、溶氧含量等培养参数，进行反应器自动控制培养。

(4)制苗毒液的繁殖：待观察微载体上细胞长满80％-90％，空球率低于5％，，满球率大于80％，细胞状态良好，且细胞计数结果达到3～5×10⁶个/mL以上进行接毒操作，按0.5-5％比例接入步骤(2)制备好的猪流行性腹泻病毒种毒，设定适合的温度、PH、搅拌速度、溶氧含量等培养参数，进行反应器自动控制培养；按0.1-5％的比例接入猪流行腹泻病毒种毒毒液，接毒后每隔一定时间取反应器中微载体，用显微镜观察细胞病变情况，并检测样品的TCID₅₀；待观察微载体上细胞基本全部脱落，且DO值呈明显上升趋势，停止反应器搅拌，待微载体全部沉到反应器底部后，收获上清液和微载体；

(5)收获病毒液的处理：收获上清液和微载体经2-3次冻融后，离心或过滤去除细胞碎片后-20℃冷冻保存备用。

上述技术方案中，生物反应器为能够自动控制温度、PH、溶氧含量、搅拌速度等参数，适用于微载体悬浮培养的生物反应器，容积为3L-3000L。

上述技术方案中，微载体为Cytodex系列微载体，微载体在使用前需清洗、灭菌，方法如下：1)用PBS浸泡微载体三小时以上；2)用PBS清洗微载体3遍；3)用PBS浸泡微载体，121℃蒸汽灭菌三十分钟。

上述技术方案中，“EDTA-胰酶细胞分散液”配方为：质量分数分别是0.25％的胰酶(1∶250)、0.02％的EDTA的Hank′s液；

上述技术方案中，“细胞生长液”的配方为：质量分数分别是90％-98％DMEM液、2％-10％牛血清、终浓度为100-200IU/mL的抗菌素，PH为6.8-7.6。

上述技术方案中，种毒接种量为0.5-5％，

上述技术方案中，“病毒培养液”配方为：含血清1-4％的DMEM液、终浓度为100-200IU/mL的抗菌素，PH调整为7.2-7.4。

上述技术方案中，生物反应器设定参数为：培养温度33-38℃、PH6.5-7.68、溶氧含量30％-70％、搅拌速度30-80rpm。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：