[发明专利]猪流行性腹泻病毒的生产方法

权利要求书

1.一种猪流行性腹泻病毒的生产方法，其特征在于：

选择生物反应器作为培养工具；选择微载体作为细胞贴附的生长载体；选择VERO细胞作为制苗用细胞系；

并包括如下步骤：

(1)制苗用细胞的传代与培养：取VERO细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液培养，培养温度为35-38℃；形成良好细胞单层时，用于继续传代或接种于生物反应器中进行微载体悬浮培养；

(2)细胞毒种的繁殖：用病毒培养液将猪流行腹泻病毒种毒按0.5-5％比例接种到步骤(1)形成的良好细胞单层继续培养，至细胞50-100％以上病变时收获病毒液；再将此病毒液作为种毒，在细胞上进行细胞适应性连续传代复壮，每次传代产物进行病毒TCID₅₀和无菌检测，传至病毒TCID₅₀稳定且达到10^7.0TCID₅₀/mL以上时停止复壮，作为生产种子；

(3)VERO细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养：生物反应器按总体积的30％-80％加入无菌细胞生长液，且每升无菌细胞生长液中按3-10g/L浓度加入微载体，启动生物反应器，低转速搅拌30分钟后，取步骤(1)转瓶上生长良好的VERO细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化制备为细胞悬液，细胞计数后按1～3×10⁵个/mL的密度接种到反应器中，设定适合的温度、PH、搅拌速度、溶氧含量培养参数，进行反应器自动控制培养；

(4)制苗毒液的繁殖：待观察微载体上细胞长满80％-90％，空 球率低于5％，满球率大于80％，细胞状态良好，且细胞计数结果达到3～5×10⁶个/mL以上进行接毒操作，按0.5-5％比例接入步骤(2)制备好的猪流行性腹泻病毒种毒，设定适合的温度、PH、搅拌速度、溶氧含量培养参数，进行反应器自动控制培养；接毒后每隔一定时间取反应器中微载体，用显微镜观察细胞病变情况，并检测样品的TCID₅₀；待观察微载体上细胞基本全部脱落，且DO值呈明显上升趋势，停止反应器搅拌，待微载体全部沉到反应器底部后，收获上清液和微载体；

(5)收获病毒液的处理：收获上清液和微载体经2-3次冻融后，离心或过滤去除细胞碎片后-20℃冷冻保存备用；

其中，所述的生物反应器为能够自动控制温度、PH、溶氧含量、搅拌速度参数，适用于微载体悬浮培养的生物反应器，容积为3L-3000L；

所述的微载体为Cytodex系列微载体，微载体在使用前需清洗、灭菌，方法如下：1)用PBS浸泡微载体三小时以上；2)用PBS清洗微载体3遍；3)用PBS浸泡微载体，121℃蒸汽灭菌三十分钟；

所述的EDTA-胰酶细胞分散液配方为：质量体积分数分别是0.25％的规格为1∶250的胰酶、0.02％的EDTA的Hank′s液；

所述的细胞生长液的配方为：质量分数分别是90％-98％DMEM液、2％-10％牛血清，并含有终浓度为100-200IU/mL的抗菌素，PH为6.8-7.6；

所述的种毒接种量为0.5-5％，病毒培养液配方为：含血清1-4％的DMEM液、终浓度为100-200IU/mL的抗菌素，PH调整为7.2-7.4； 

所述的生物反应器设定参数为：培养温度33-38℃、PH6.5-7.68、溶氧含量30％-70％、搅拌速度30-80rpm。