[发明专利]一种含CpG ODN和poly I:C佐剂的喷鼻型流感病毒疫苗制备方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种含CpG ODN和poly I:C佐剂的喷鼻型流感疫苗的制备方法。

背景技术：

流感是由流感病毒引起的全球流行的呼吸道传播疾病，接种流感疫苗是预防流感的有效手段。

传统的流感病毒疫苗包括流感全病毒灭活疫苗、流感病毒裂解疫苗和流感亚单位疫苗，这些流感疫苗均采用肌肉注射方式。在俄罗斯和美国已经批准流感减毒活疫苗，该疫苗采用冷适应的流感重组株经鼻腔喷雾给药，但该疫苗未被批准用于3岁以下婴幼儿使用。

CpG ODN(oligodeoxynucleotides，ODN)是一种含有非甲基化CpG二核苷酸序列的单链寡核苷酸，CpG ODN可以被免疫细胞上Toll样受体-9(Toll-like receptor 9，TLR-9)所识别，并增强免疫反应。美国Dynavax公司以CpG ODN为佐剂的重组乙肝疫苗在三期临床研究中显示了优于普通乙肝疫苗的免疫效果，接种两针后抗体阳转率达到95％，而普通乙肝疫苗接种三针阳转率为81％。

Poly I:C，即聚肌苷酸-聚胞苷酸(polyinosine-polycytidylic acid，poly I:C)是一种合成的双链RNA，Poly I:C可被免疫细胞上的Toll样受体-3(Toll-like receptor 3，TLR-3)所识别，并增强免疫反应。目前以PolyI:C主要作为免疫刺激剂、肿瘤治疗药物使用，使用Poly I:C作为佐剂的狂犬病疫苗和流感疫苗尚处于临床前研究阶段。

传统的流感病毒疫苗为流感病毒灭活全病毒疫苗或流感病毒裂解疫苗，成人剂量含每型血凝素15微克，儿童剂量含每型血凝素7.5微克，由于传统疫苗使用肌肉注射方式进行接种，而利用本专利制备的含CpG ODN和poly I:C佐剂的喷鼻型流感病毒疫苗采用喷鼻给药方式，接种方式更方便，并可以降低抗原用量，增加疫苗供应能力。

以CpG ODN和PolyI:C两种佐剂制备喷鼻型流感疫苗目前国内外未见文献报道。

发明内容：

本发明克服了传统流感疫苗的缺陷，提供了一种免疫效果好、可以降低流感病毒抗原用量，方便使用的喷鼻型流感疫苗，且可以应付流感大流行之下。

本发明的技术方案及步骤：

(1)将H1N1、H3N2、B型流感病毒工作毒种分别接种于1000枚10日龄健康鸡胚尿囊腔增殖流感病毒；

(2)收获流感病毒，用截留分子量100～750kD的超滤膜进行超滤浓缩；

(3)将超滤浓缩后的流感病毒样品上样于充分平衡的Sepharose 4FF柱，收集第一个洗脱峰为纯化的流感病毒；

(4)经脱氧胆酸钠裂解的流感病毒样品，上样于Sepharose 6FF柱，纯化获得流感病毒疫苗原液；

(5)将以上步骤分别得到的H1N1、H3N2、B型流感病毒疫苗原液混合；

(6)按照每剂含H1N1流感病毒血凝素和H3N2流感病毒血凝素和B型流感病毒血凝素1～10微克、CpG ODN佐剂50～1000微克、poly I:C佐剂100～2000微克的配比，分装到喷鼻注射器即获得含CpG ODN和poly I:C佐剂的喷鼻型流感病毒疫苗。

其中流感病毒浓缩过程中使用的超滤膜截留分子量可以为300～750kD；疫苗含每型流感病毒血凝素可以为2～7.5微克/剂，CpG ODN佐剂可以为100～500微克/剂、polyI:C佐剂可以为200～1000微克/剂，疫苗不含有硫柳汞。

本发明的有益效果是：利用CpG ODN和PolyI:C的佐剂作用和增强粘膜免疫的特性，使得可以在降低流感病毒抗原用量的同时保持高的免疫效果从而可扩大流感病毒疫苗的生产量，同时可以采用喷鼻剂型代替传统流感病毒疫苗的注射剂型，从而获得一种可以喷鼻的流感病毒疫苗，同时本发明制备的疫苗不含有硫柳汞，使用安全性更高。本发明制备的含CpG ODN和poly I:C佐剂的喷鼻型流感病毒疫苗，尤其适宜于在全球大流感流行威胁下应急增加流感病毒疫苗生产能力，对于保证公共卫生安全具有重要意义。

具体实施方式：

实施例1

1)增殖流感病毒

将H1N1、H3N2、B型流感病毒工作毒种分别接种于1000枚10日龄健康鸡胚尿囊腔，置34℃培养72小时；

2)收获流感病毒，超滤浓缩