[发明专利]具合成头孢菌素酸类酶活性的生物催化剂的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及采用含头孢菌素酸合成活性的大肠埃希菌细胞制备非均相生物催化剂(Biocatalyst，BC)的方法。

背景技术

据文献报道，具有青霉素酰基转移酶活性的细胞的固定化方法主要采用戊二醛交联处理细胞，经戊二醛交联后的细胞增强了细胞壁的通透性，有助于渗透到多聚酰胺球形颗粒中。胶粒制备的聚合工艺始于氧化还原对，其中，N，N，N′，N′-四甲基乙二胺是促进剂，过硫酸铵是引发剂。现有的生物催化剂是特指把青霉素G经酶法水解生成6-氨基青霉烷酸产物(6-APA)的酶，但生物催化的酶活性很低，不到8U/g。

已知的微生物细胞(包括大肠埃希氏菌细胞)的固定化方法是将细胞共价结合到交叉连接多聚物(胶)上，而多聚物则是通过不同的单体，主要是丙烯酸单体，共聚作用生成的。在聚合过程中，细胞要么与制备好的聚合物结合，要么与单体结合起来后再用多功能基的联结剂如戊二醛进行处理。在细胞与聚合物或者单体结合之前，需先经包括戊二醛在内的含多功能基的交联剂处理。β-二甲基氨基丙腈与过硫酸铵形成的氧化还原对引发单体聚合。已报道的专利都没有生物催化剂固定化大肠埃希氏菌细胞的制备实例，但包含了具有青霉素酰基转移酶活性的雷极氏变形杆菌(roteusrettgeri)细胞的固定化方法的介绍，此方法可用于具有酶水解青霉素G生成6-APA活性的生物催化剂的制备。即使以最稳定的结构式存在，此生物催化剂的操作稳定性仍然很差，催化青霉素G水解进行20个循环，反应约60个小时后，生物催化剂的活性降低2倍。

把与本发明方法最接近的文献方法叫做原型方法。

本发明为具有催化β-内酰胺类抗生素转化活性的生物催化剂固定化细胞的制备方法。原型方法中，水解青霉素G的生物催化剂的制备是通过截留大肠埃希氏菌细胞中的青霉素酰胺酶(青霉素水解酶)进入多聚酰胺的胶来实现的。原型方法由以下几点构成：大肠埃希氏菌菌株ATCC 9637在含有有机碳源和有机氮源及无机盐的培养基中30℃培养。生物合成进行24小时。生物培养终止点无任何特别的判据。将培养的菌丝体悬浮于聚丙烯酰胺胶单体(丙烯酰胺和N，N′-亚甲基双丙烯酰胺)，向混合物中加入聚合促进剂(β-二甲基氨基丙腈)和引发剂(过硫酸钾)，胶即形成。细胞的加入量为每克聚合混合物加入33mg干重细胞，即C_c.b.＝33mg干重/g聚合混合物；将聚合生成的凝胶切成小颗粒，再用水洗涤。

原型方法的主要缺点如下：细胞在固定化时缺少的共价交联的固着点会导致酶转化形成的目标产品有被天然有机混合物污染的可能，例如反应一开始就会被从生物催化剂上脱落的蛋白所污染；且原型方法固定化的细胞活性比较低。原型方法生物催化剂的酶活仅为22U/g(按水解青霉素G来计算)。对于催化β-内酰胺类抗生素的合成特别是头孢菌素酸的合成，该方法制备的生物催化剂的活性很难确定。

参照原型方法实施细胞固定化，用大肠埃希氏菌VKPM B-10182菌株细胞(见实施例3)生成头孢菌素酸合成酶，能够得到有头孢唑啉合成酶活性的生物催化剂即固定化细胞，其活性(以合成头孢唑啉计)约40U/g湿细胞(相当于300U/g干细胞)，固定化收率约50％。但这些生物催化剂活性低，不宜用于装有搅拌的批量反应器中进行反应。在此种反应器中合成则需要生物催化剂的活性不低于60U/g湿细胞(相当于330U/g干细胞)。按照原型方法生产的生物催化剂的活性也差。在加速失活条件下(40℃，pH6.5)生物催化剂失活一半的时间(半衰期)仅为20小时：这不仅是酶的热失活，而且是酶从其胶质流失的机械性损失。温和条件下(1g生物催化剂置于3ml缓冲液，20℃，1小时)单一生物催化剂用pH7.5的0.1M磷酸盐缓冲液冲洗，合成酶活性的损失约为30％。上清液中脱落的蛋白总量结果显示每1g蛋白损失5mg目标蛋白。由于酶转化合成的目标产物会不可避免地遭到脱落蛋白质类的污染，因此使用这样的生物催化剂来催化合成β-内酰胺类抗生素几乎是不可能的。

发明内容

该项技术发明旨在解决以下问题：

如何提高具有合成头孢菌素酸活性的生物催化剂的活性；

如何提高具有合成头孢菌素酸活性的生物催化剂的稳定性；

制备的生物催化剂在使用其催化合成的目标产物过程中蛋白质不会脱落，所以不会造成目标产物的污染。

本发明通过连续使用多项条件优化的技术手段来解决前述原型方法制备生物催化剂过程中存在的问题。