[发明专利]应用倾斜旋转瓶进行微载体细胞培养的方法

说明书

技术领域

微载体细胞培养是大规模细胞培养的主要方法，常规的用于微载体细胞培养的生物反应器价格昂贵，结构复杂，需要专业的操作人员使用，本发明涉及的应用倾斜旋转瓶进行微载体细胞培养的方法，操作简单，使微载体细胞培养如同普通的细胞瓶细胞培养一样容易。

背景技术

由于传统的转瓶单细胞层培养有着劳动量大，所需瓶数量多，容易污染微生物，耗能大，产生污物多等缺点，微载体细胞培养技术日益受到关注。而进口的生物反应器价格昂贵，国产的生物反应器便宜一些，培养效果和稳定性又不好保证。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种应用倾斜的旋转瓶(如3L转瓶等)进行微载体细胞培养，达到高细胞密度，经济实用。

本发明所采用的技术方案是：应用转瓶、可以进行倾斜旋转重力混合生物反应试验的装置于31℃～39℃进行大规模微载体细胞培养的方法。

其所用的转瓶可为透明转瓶(如3L玻璃转瓶等)，使用前可对转瓶内部进行浓硫酸重铬酸钾浸泡过夜后清洗晾干处理，并可进行硅化处理以减少细胞和微载体在转瓶内壁的吸附。

其所用的转瓶在每次使用前可进行干热灭菌或NaOH溶液处理，以除去热源。

其所用的微载体可为球状微载体(如GE公司的Cytodex 1等)、片状微载体(如NBS公司的Disk等)，按照相应的方法水化处理后，装在转瓶内灭菌，接种细胞前，可用预温处理的含有血清等的DMEM或DMEM/F12等细胞培养液洗涤1～5次；也可在灭菌前用不含谷氨酰胺的DMEM等溶液洗涤微载体1～5次后高压蒸汽灭菌，接种细胞前补加谷氨酰胺、血清等。

其待接种的细胞经胰蛋白酶等消化成单细胞悬液后，按照每10⁷个细胞接种500～5000cm²的微载体的接种量进行细胞接种，接种的细胞可为原代细胞(如地鼠肾细胞等)、传代细胞(Vero细胞等)，人二倍体细胞(如MRC-5细胞、2BS细胞等)等，补加培养基至培养体积。

其接种细胞后，放置于37℃温室或温箱内的倾斜旋转重力混合生物反应装置进行5～80度倾斜旋转培养，旋转速度为1～300转/分钟。根据细胞生长情况，以1次/4天～4次/1天换液频率进行更换细胞培养液。培养5～15天细胞长满微载体。

其长满微载体的细胞，可进行单抗的目的蛋白的表达；可接种病毒于31℃～39℃温室或温箱内5～80度倾斜旋转培养进行病毒扩增培养；可用于作为更大规模培养的细胞种子。

其微载体和细胞为旋转过程中依靠重力主动沉降混合，具有较低的剪切力。

其培养过程中除了定期换液，可不做任何在线检测，可不做任何在线补加氧气、氮气、二氧化碳气体、压缩空气、酸、碱等操作。

附图说明

图1应用倾斜旋转瓶进行微载体细胞培养工艺图

具体实施方案

本发明所采用的技术方案是：应用转瓶、可以进行倾斜旋转重力混合生物反应试验的装置于31℃～39℃进行大规模微载体细胞培养的方法。

其所用的转瓶可为透明转瓶(如3L玻璃转瓶等)，使用前可对转瓶内部进行浓硫酸重铬酸钾浸泡过夜后清洗晾干处理，并可进行硅化处理以减少细胞和微载体在转瓶内壁的吸附。

其所用的转瓶在每次使用前可进行干热灭菌或NaOH溶液处理，以除去热源。

其所用的微载体可为球状微载体(如GE公司的Cytodex 1等)、片状微载体(如NBS公司的Disk等)，按照相应的方法水化处理后，装在转瓶内灭菌，接种细胞前，可用预温处理的含有血清等的DMEM或DMEM/F12等细胞培养液洗涤1～5次；也可在灭菌前用不含谷氨酰胺的DMEM等溶液洗涤微载体1～5次后高压蒸汽灭菌，接种细胞前补加谷氨酰胺、血清等。

其待接种的细胞经胰蛋白酶等消化成单细胞悬液后，按照每10⁷个细胞接种500～5000cm²的微载体的接种量进行细胞接种，接种的细胞可为原代细胞(如地鼠肾细胞等)、传代细胞(Vero细胞等)，人二倍体细胞(如MRC-5细胞、2BS细胞等)等，补加培养基至培养体积。

其接种细胞后，放置于37℃温室或温箱内的倾斜旋转重力混合生物反应装置进行5～80度倾斜旋转培养，旋转速度为1～300转/分钟。根据细胞生长情况，以1次/4天～4次/1天换液频率进行更换细胞培养液。培养5～15天细胞长满微载体。

其长满微载体的细胞，可进行单抗的目的蛋白的表达；可接种病毒于31℃～39℃温室或温箱内5～80度倾斜旋转培养进行病毒扩增培养；可用于作为更大规模培养的细胞种子。