[发明专利]幽门螺杆菌诊断试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种幽门螺杆菌诊断试剂盒及其检测方法，属于细菌的检测技术领域。

背景技术

自从澳大利亚学者Marshall等1983年首次从胃炎患者的胃黏膜中分离到幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，HP)后，经过20多年的发展，有关幽门螺杆菌临床检测的研究取得了长足进步。截止目前为止，主要有快速尿素酶试验，细菌培养，活检标本切片染色，直接图片染色和聚合酶链反应(PCR)，碳13，碳14呼吸试验，血清免疫学检测，尿素排泄试验等，各种方法各有优缺点。焦磷酸测序是近年来发展起来的一种快速，简便，高通量的短序列测序方法，本试验将其应用于幽门杆菌的鉴定及耐药性分析，具有准确，特异，快速及高通量的优点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的不足，提供一种幽门螺杆菌诊断试剂盒。

本发明还要解决的技术问题是提供上述试剂盒的检测方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种幽门螺杆菌诊断试剂盒，它包括：

(1)特异性扩增幽门螺杆菌引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示引物对；

(2)幽门螺杆菌特异性测序引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

(3)特异性扩增幽门螺杆菌耐药基因引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：4和SEQID NO：5所示的引物对；

(4)幽门螺杆菌耐药基因特异性测序引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；

其中，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3均在5’端标记生物素；

上述引物在一次检测中共同使用。

上述幽门螺杆菌诊断试剂盒，具体包括如下试剂：

(1)DNA提取试剂：裂解液，生理盐水，PBS；

其中，裂解液具体包括：Chelex(g/mL)5％，Tricine 30mM，辛酸钠150mM，盐酸胍150mM，Triton 0.1％(v/v)；生理盐水具体为：0.9％(g/mL)氯化钠溶液；PBS具体包括：NaCl1.37M，KCl 27mM，Na₂HPO₄100mM，KH₂PO₄20mM。

(2)PCR反应液：PCR Buffer，特异引物SEQ ID NO：1～610uM，MgCl₂25mM，dNTPs 10mM，Taq DNA聚合酶5U/uL；

其中，PCR Buffer包括0.1％(v/v)NP-40，0.02％(v/v)明胶，0.06％(g/mL)BSA，0.1％(v/v)Tween-20，0.06M pH8.9Tricine。

(3)单链纯化试剂：75％(v/v)乙醇溶液，0.2M NaOH，10mM pH 7.6Tris-Acetate，结合缓冲液，退火缓冲液；

其中，结合缓冲液具体为：10mM Tris-HCl，2M NaCl，1mM EDTA，0.1％(v/v)Tween20；退火缓冲液具体为：20mM pH 7.6Tris-Acetate，2mM醋酸镁；

(4)测序试剂：DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶，三磷酸腺苷双磷酸酶，APS，荧光素和dNTP(dNTP即dATP S，dTTP，dCTP，dGTP)。

一种幽门螺杆菌诊断试剂盒，它包括上述所有核苷酸序列的碱基互补序列，也就是包括：

(1)特异性扩增幽门螺杆菌引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示引物对；

(2)幽门螺杆菌特异性测序引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；

(3)特异性扩增幽门螺杆菌耐药基因引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：10和SEQID NO：11所示引物对；

(4)幽门螺杆菌耐药基因特异性测序引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示；

其中，SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9均在5’端标记生物素；

上述引物在一次检测中共同使用。

上述幽门螺杆菌诊断试剂盒，具体包括如下试剂：

(1)DNA提取试剂：裂解液，生理盐水，PBS；