[发明专利]幽门螺杆菌诊断试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种幽门螺杆菌诊断试剂盒，其特征在于它包括：

(1)特异性扩增幽门螺杆菌引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示引物对；

(2)幽门螺杆菌特异性测序引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

(3)特异性扩增幽门螺杆菌耐药基因引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：4和SEQIDNO：5所示的引物对；

(4)幽门螺杆菌耐药基因特异性测序引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；

其中，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3均在5’端标记生物素；

上述引物在一次检测中共同使用。

2.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌诊断试剂盒，其特征在于它包括如下试剂：

(1)DNA提取试剂：裂解液，生理盐水，PBS；

(2)PCR反应液：PCR Buffer，特异引物SEQ ID NO：1～610uM，MgCl₂ 25mM，dNTPs 10mM，Taq DNA聚合酶5U/uL；

(3)单链纯化试剂：75％(v/v)乙醇溶液，0.2M NaOH，10mM pH 7.6Tris-Acetate，结合缓冲液，退火缓冲液；

(4)测序试剂：DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶，三磷酸腺苷双磷酸酶，APS，荧光素和dNTP。

3.一种幽门螺杆菌诊断试剂盒，其特征在于它包括权利要求1所述的所有核苷酸序列的碱基互补序列，也就是包括：

(1)特异性扩增幽门螺杆菌引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示引物对；

(2)幽门螺杆菌特异性测序引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；

(3)特异性扩增幽门螺杆菌耐药基因引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：10和SEQID NO：11所示引物对；

(4)幽门螺杆菌耐药基因特异性测序引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示；

其中，SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9均在5’端标记生物素；

上述引物在一次检测中共同使用。

4.根据权利要求3所述的幽门螺杆菌诊断试剂盒，其特征在于它包括如下试剂：

(1)DNA提取试剂：裂解液，生理盐水，PBS；

(2)PCR反应液：PCR Buffer，特异引物SEQ ID NO：7～1210uM，MgCl₂ 25mM，dNTPs 10mM，Taq DNA聚合酶5U/uL；

(3)单链纯化试剂：75％(v/v)乙醇溶液，0.2M NaOH，10mM pH 7.6Tris-Acetate，结合缓冲液，退火缓冲液；

(4)测序试剂：DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶，三磷酸腺苷双磷酸酶，APS，荧光素和dNTP。

5.一种幽门螺杆菌诊断试剂盒的检测方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)幽门螺杆菌DNA模板的提取；

(2)以步骤(1)所得的DNA为模板再按特异性扩增幽门螺杆菌引物进行PCR扩增；

(3)将步骤(2)得到的PCR扩增产物以标记生物素的引物序列进行单链纯化；

(4)将步骤(3)所得的单链纯化产物进行测序；

(5)结果分析。

6.根据权利要求5所述的幽门螺杆菌诊断试剂盒的检测方法，其特征在于步骤(1)中所述的幽门螺杆菌DNA模板的提取，具体方法是：称取20mg胃黏膜组织，加1mL生理盐水在研钵中研磨成匀浆状，倒入1.5mL离心管中，13000rpm离心5min，弃上清，用PBS洗涤3次后13000rpm离心沉淀，加50μL裂解液，100℃ 10min，13000rpm离心，上清即为DNA模板。

7.根据权利要求5所述的幽门螺杆菌诊断试剂盒的检测方法，其特征在于步骤(2)中所述的PCR扩增具体方法为：

50μL体系：Template 5μL，10×PCR Buffer 5μL，MgCl₂ 4μL，dNTP 1μL，SEQ ID NO：1 1μL，SEQ ID NO：2 1μL，5U/uL Taq DNA聚合酶0.4μL，ddH₂O 32.6μL；或者将SEQID NO：7替换SEQ ID NO：1，同时将SEQ ID NO：8替换SEQ ID NO：1，其它体系不变；

PCR扩增条件：95℃ 3min；95℃ 30s，45℃ 30s，72℃ 45s，50个循环；72℃ 3min，16℃ 30min。