[发明专利]一种从植物提取物中筛选1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构化酶抑制剂的方法

说明书

技术领域

本发明属于抗生素的筛选领域，涉及一种从植物提取物中筛选1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构化酶(DXR)抑制剂的简单方法。

背景技术

萜类化合物存在于几乎所有的生命形式中，它们在生物体中发挥着重要的作用，如长醇焦磷酸酯(dolichol diphosphates)对细胞壁及糖蛋白生物合成的调节作用；醌类化合物(如质体醌和辅酶Q)可作为电子转移及氧化还原反应的载体；类胡萝卜素及叶绿素的侧链参与光合作用；甾体可帮助构成细胞膜(如胆固醇)；雌激素参与细胞间信号传递过程并可控制个体的生长发育；甜椒醇(capsidiol)等可作为抗菌素及植物抗毒素用于物种间相互防御；赤霉素、脱落酸可作为植物激素；维生素A的存在可促进视网膜的正常功能，缺乏则导致夜盲症；维生素D能促进钙、磷在肠内的吸收，维持血钙血磷的平衡，促进骨质的钙化等。同时，植物中所含的其它一些萜类化合物通常作为植保素，在调节植物与环境的关系上发挥重要的生态功能。许多萜类化合物还具有很好的生物活性，是天然药物的主要有效成分，如目前广泛使用的抗疟药物青蒿素、抗心血管疾病的银杏内酯及具有很强抗癌活性的化合物紫杉醇等。

长期以来，生物体内的萜类化合物被认为是由辅酶A经甲羟戊酸而合成，并认为甲羟戊酸是萜类化合物生物合成的唯一前体，故该生物合成途径被称为甲羟戊酸途径。但到上世纪九十年代初，人们发现萜类化合物的生物合成除甲羟戊酸途径外，还存在一条非甲羟戊酸途径，由于1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸(DXP)和2-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸(MEP)是这一新途径中的两个重要中间体，故称为DXP/MEP途径，现简称为MEP途径。

最新研究证明，动物(包括人类)主要通过经典的甲羟戊酸途径来合成其所需的萜类化合物，而包括人类的致病菌在内的大多数细菌则是利用MEP途径来合成其所必需的萜类化合物。这种人类和其主要致病菌分别采用完全不同的生物途径来合成维持它们生命活动所必需的萜类化合物的事实，为人们提供了一个利用MEP途径中的酶为靶标进行新型抗菌素筛选的强有力的方法，而使用该方法进行抗菌素筛选的最大优点在于筛选的过程不需考虑药物的选择性。因此，这条新发现的MEP途径在新类型抗菌素的发现方面将具有非常广阔的应用前景，尤其是在当前病菌对现存的各种抗菌素的耐受性日益提高的情况下。目前，对该生物合成途径中的酶及它们的作用机理的研究已成为一个热点，尤其是对1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构化酶(DXR)的研究更加广泛和深入。

Zenk、Bacher等人(US2009199313等)曾对MEP途径中酶的抑制剂筛选方法进行了尝试，但是他们所建立的方法使用的底物都是含有同位素标记的化合物，通过测定产物的生成情况来判断抑制大小，所采用的检测方法包括放射性测定法及核磁共振法等，而使用及测定具有放射性的物质时要求有单独的放射性物质操作室及专门的测定仪器，核磁共振法更是需要昂贵的核磁共振仪，这都使得这些方法很难适合普通实验室的研究工作。Gottlin等人建立了时间分辨荧光光谱法(time-resolved fluorescence)，通过测定反应过程中NADPH被氧化时吸收信号的衰减来高通量地筛选DXR的抑制剂(J.Biomol.Screening，2003，8，332-339)，该法不适合植物提取物中DXR抑制剂的筛选，主要是因为植物提取物中的有些成分会干扰测定过程。Kaiser等人研究了地中海地区一些植物的提取物对DXR的抑制情况，发现洋苏木提取物活性最好，但该法以核磁共振法作为检测手段，使其应用受到很大限制(Phytomedicine，2007，14，242-249)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单快速的DXR抑制剂的筛选方法，该方法适用于在实验室中采用常见的纸色谱法(PC)、薄层色谱法(TLC)、或反相离子对高效液相色谱法等检测手段从植物提取物中筛选DXR的抑制剂，解决了背景技术中筛选DXR抑制剂的方法需要大型昂贵的仪器来检测，如核磁共振仪等，检测成本高的技术问题。

本发明的技术解决方案如下：

为了解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种从植物提取物中筛选1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构化酶(DXR)抑制剂的方法。该方法是以常见的色谱方法来检测底物的消耗量或产物的生成量的分析方法，在此基础上判断植物提取物对DXR酶催化活性的影响，进而发现DXR酶的有效抑制剂。

其原理是：

1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构化酶(DXR)催化DXP还原异构化为MEP的过程如以下反应式所示：