[发明专利]一种从植物提取物中筛选1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构化酶抑制剂的方法

权利要求书

1.一种从植物提取物中筛选1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构化酶抑制剂的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤

(1)用于检测1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构化酶抑制剂的样品的制备

将未标记的底物1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸、辅酶NADPH、1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构化酶DXR和二价金属离子加入到缓冲液中，再加入植物提取物，该反应体系反应，制备出用于检测DXR抑制剂的样品；

(2)对照样的制备

将未标记的底物1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸、辅酶NADPH、DXR和二价金属离子加入到缓冲液中，该反应体系反应，制备出对照样；

(3)色谱法检测

用纸色谱法、高效液相色谱法或薄层色谱法检测步骤(1)的样品和步骤(2)的对照样中的1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸的转化情况；以对照样为参比，根据各样品中底物1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸的转化量是否减少来判断所加植物提取物对DXR活性有无影响，进而筛选出DXR的有效抑制剂。

2.根据权利要求1所述的从植物提取物中筛选DXR抑制剂的方法，其特征在于：步骤(3)色谱法是薄层色谱法时，在色谱检测前先要对步骤(1)样品和步骤(2)对照样进行预处理，其方法是，分别在步骤(1)样品和步骤(2)对照样中加入5-50U的磷酸酶，所述磷酸酶包括碱性磷酸酶或酸性磷酸酶；在30-40℃水浴中继续反应2-8h，减压蒸去反应混合物中的水，用有机溶剂提取，将提取液减压浓缩；

3.根据权利要求2所述的从植物提取物中筛选DXR抑制剂的方法，其特征在于：步骤(3)以预处理后的对照样为参比，用硅胶板进行薄层色谱法检测各预处理后的样品中1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸的转化情况，包括以下步骤：

1)点样及展开：取反应样品及对照样点样，点样量0.5-2μl，展开系统为氯仿∶甲醇∶水＝3∶1∶0.1(v/v/v)或丙酮∶氯仿＝3∶1(v/v)；室温下展开，待溶剂前沿至硅胶板长度的4/5时，将硅胶板取出，室温晾干；

2)显色：晾干的硅胶板喷洒2％-8％硫酸乙醇溶液后90-110℃下加热5-20min显色；

3)观察：观察硅胶板上DX及ME的斑点变化。

4.根据权利要求1所述的从植物提取物中筛选DXR抑制剂的方法，其特

征在于：步骤(3)以对照样为参比，用纸色谱法检测各样品中1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸的转化情况，包括以下步骤：

1)点样及展开：取反应样品点样，点样量1-10μl，同时以对照样为参比；展开剂为95％乙醇∶1M乙酸胺∶1M EDTA＝70∶29∶1(v/v/v)；室温下展开，待溶剂前沿至滤纸长的2/3位置处，将滤纸取出，室温下晾干；所述滤纸为实验室常用定性滤纸；

2)显色：用5％-20％硫酸乙二胺的水溶液或醇溶液为显色剂显色，喷洒后90-110℃下加热5-20min；或以0.01-0.05M 2，4-二硝基苯肼的1％HCl溶液为显色剂，喷洒后室温下放置5-20min；

3)观察：在紫外灯下观察样品与对照样品中底物1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸转化量的变化情况，进而确定植物提取物对DXR的抑制情况。

5.根据权利要求1所述的从植物提取物中筛选DXR抑制剂的方法，其特征在于：步骤(3)以对照样为参比，用高效液相色谱法检测各样品中1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸的转化情况，包括以下步骤：

1)上样：取2-10μl待测样品，1∶10稀释后过滤进入高效液相色谱法系统中，同时以相同的方式处理对照样；

2)检测：反相离子对高效液相色谱法梯度洗脱并检测待测样品及对照样中DXP含量；

3)分析：根据样品与对照样品中底物1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸转化量的差异，分析植物提取物对DXR活性的影响。