[发明专利]一种采用重组大肠杆菌生产氧化型PVA水解酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种氧化型PVA水解酶(oxidized polyvinyl alcohol hydrolase，EC3.7.1.7，简称OPH)的生产方法，特别是一种采用大肠杆菌生产氧化型PVA水解酶的方法，属于纺织生物技术领域。

背景技术

PVA(全称polyvinyl alcohol)，即聚乙烯醇，是一种人工合成的水溶性的高分子化合物。凭借其在物理性质：黏度、柔韧性、抗拉强度、弹性、pH稳定性等方面的优良特性，PVA可用于生产涂料、粘合剂、纤维浆料、纸品加工剂、乳化剂、分散剂、薄膜等产品，现已广泛应用于纺织、造纸等轻工业领域。

但是伴随着PVA在工业上的大量应用，尤其是纺织工业中，在退浆的时候大量的PVA也随着污水进入到河流当中，其稳定的物理性质使其很难被降解，因此造成很大的污染。目前在纺织工业中，传统的退浆过程是用高温加酸/碱或是用氧化剂来破坏PVA的长链结构使其降解，但是与此同时也对棉纤维造成了较大的损伤，而且十分浪费能源！于是人们寻求运用生物降解的方法来处理PVA，这样做既节约能源又环保。

一般来讲，PVA的生物降解的分两步进行一般来讲，PVA的降解主要是两步反应：①在PVA脱氢酶(PVADH)或者仲醇氧化酶(SAO)的催化作用下，PVA上的羟基被氧化成羰基，形成β-二酮结构，即氧化型PVA(oxidized PVA)；②在β-二酮水解酶(BDH)或者氧化型PVA水解酶(OPH)的催化作用下，将β-二酮键切开形成一分子的羧酸结构和一分子甲基酮结构。

2005年，Wilailak Klomklang等人报道了Sphingopyxis sp.113P3中OPH的基因序列，该序列含有1095bp，编码364个氨基酸残基，其中包括一个信号肽和一个成熟蛋白质(WilailakKlomklang et al，Biochemical and molecular characterization of a periplasmic hydrolase foroxidized polyvinyl alcohol from Sphingomonas sp.strain 113P3)。在进一步的研究发现，OPH为胞外酶，分布在周质空间内，呈组成型表达，底物特异性比较高，仅对氧化型PVA和对硝基苯酚乙酸酯(PNPA，氧化型PVA的替代物)有催化效果。OPH的氨基酸序列中有脂肪酶共识学列，而且可以被丝氨酸蛋白特异性抑制剂(PMSF)完全抑制，据此推断OPH为丝氨酸型水解酶。但是在做oph基因克隆表达的时候，重组蛋白却没有催化氧化型PVA和对硝基苯酚乙酸酯(PNPA，氧化型PVA的替代物)的活性。而且OPH底物特异性较强，仅对氧化型PVA和PNPA有催化效果。

国外对PVA水解酶的研究主要侧重于其基因报道和降解机理上，而对PVA水解酶酶活的提高以及进一步的工业化生产研究很少，鉴于PVA水解酶广阔的应用前景而且目前PVA酶活较低的现实情况，构建出高产、有效分泌到胞外及诱导方式廉价的基因工程菌是急待解决的问题。

我国对PVA降解的研究主要侧重于发酵优化，即从自然界筛选菌株进而进行发酵优化或者是进行混菌发酵，以此来提高PVA水解酶酶活。但是，几乎没有关于PVA水解酶基因工程菌的研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种采用大肠杆菌生产表达氧化型PVA水解酶(OPH)的方法，其特征在于，化学合成氧化型PVA水解酶的基因序列(oph)，构建重组质粒pET-20b(+)-oph，该基因工程菌为将重组质粒转化入重组大肠杆菌(Escherichia coli)JM109，得到分泌表达氧化型PVA水解酶的基因工程菌JM109-oph，发酵培养3-4天。

所述氧化型PVA水解酶的基因(oph)序来源于Sphingopyxis.sp.113P中含oph基因的操纵子(GenBank No.AB190288)，替换掉oph基因中的一个EcoRI限制性内切酶位点，将EcoR I限制性内切酶和Nco I限制性酶切位点分别加在含有氧化型PVA水解酶基因的DNA序列(oph)的5′端及3′端，修饰后的核苷酸序列为：SEQ ID NO：1。

SEQ ID NO：1

CCATGGATGTTCAAACCAGTTGTCAAGTCCCGTTCCTCTCGTTCTTTTTGTTACCT

GGCAGGTTGTCTGGCTATGGTCGCTGCTACTCTGTCCTCTACTGCACAGGCTAAAT