[发明专利]一种采用重组大肠杆菌生产氧化型PVA水解酶的方法

权利要求书

1.一种采用大肠杆菌生产表达氧化型PVA水解酶(OPH)的方法，其特征在于，化学合成氧化型PVA水解酶的基因序列(oph)，构建重组质粒pET-20b(+)-oph，重组质粒转化大肠杆菌(Escherichia coli)JM109，得到分泌表达氧化型PVA水解酶的基因工程菌JM109-oph，发酵培养3-4天。

2.根据权利要求1所述的氧化型PVA水解酶的基因(oph)，其特征在于，序列来源于Sphingopyxis.sp.113P中含oph基因的操纵子(GenBank No.AB190288)，替换掉oph基因中的一个EcoR I限制性内切酶位点，将EcoR I限制性内切酶和Nco I限制性酶切位点分别加在含有氧化型PVA水解酶基因的DNA序列(oph)的5′端及3′端，修饰后的核苷酸序列为：SEQ ID NO：1。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，大肠杆菌JM109-oph生产氧化型PVA水解酶(OPH)的工艺为：

甘油管：甘油浓度为20％；种子培养基组成为：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，麦芽浸出物0.05g/L，pH 7.0，100μg/mL氨苄青霉素；发酵培养基组成为：葡萄糖5g/L，甘露糖5g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，磷酸二氢钾3g/L，麦芽浸出物0.05g/L，pH 7.0，100μg/mL氨苄青霉素；

种子培养：从甘油管中按1％的接种量接入250mL三角瓶，装液量50mL，回旋式摇床转速200r/min，培养温度为37℃，培养8h；发酵培养：将培养好的种子培养液按4％(v/v)的接种量接种至装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中进行培养，开始培养温度为30℃，摇床转速200r/min，当菌体培养至OD₆₀₀为0.6时，加入IPTG后迅速转至不同温度的摇床，继续诱导3-4天。