[发明专利]基于环介导等温扩增技术的鸡传染性支气管炎病毒快速检测试剂盒及其使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体涉及基于环介导等温扩增技术检测鸡传染性支气管炎病毒快速检测试剂盒， 

背景技术

禽传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis，IB)是由冠状病毒科冠状病毒属的禽传染性支气管炎病毒(Avian InfectiousBronchitis Virus，IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病，其特征为病鸡出现呼吸道症状、产蛋数量和品质下降以及肾脏病变等。该病呈世界广泛流行，是严重危害世界养禽业的重大传染病之一。 

目前，鸡传染性支气管炎病毒的检测方法包括传统的血凝和血凝抑制、ELISA、中和试验和RT-PCR方法。传统的检测方法耗时长、操作繁琐。PCR法具有特异性强、灵敏度高和速度快等优点，但因RT-PCR容易交叉污染、操作繁琐、需要的热循环设备价格昂贵等缺点而很难得到推广。而实时荧光定量PCR虽然较好地解决了交叉污染的问题，并简化了操作过程，但却需要更复杂的定量仪器，因此不适于现场快速检测。而且实时定量PCR荧光探针的成本较高，加大了推广应用的难度。 

环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplication，LAMP)是Notomi等在2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，其原理是针对目的基因的6个区域设计4条特异性引物，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)在等温65℃左右，几十分钟，即可实 现核酸的高效扩增。4条引物对靶序列的6个特异序列区域的识别，保证了LAMP扩增的高度特异性。LAMP不需要模板的热变性，长时间温度循环，在等温条件下扩增，不会因温度改变而造成时间的浪费。有无肉眼可见的焦磷酸镁的白色沉淀，成为判断核酸是否扩增的最简单的方法。增加环引物的LAMP方法，使反应时间缩短一半，可以在不到30min内完成，大大提高了检测的效率，环状引物与茎环结构结合的区域在F2和F1之间(或是B2和B1之间)，以F1到F2的方向或是B1到B2的方向结合。这样，茎环DNA或者与内引物杂交，或者与环状引物杂交来启动链置换DNA的合成，从而加快了反应速度。环介导等温扩增技术在病原核酸检测技术上具有很多优点，但是目前还未见有应用环介导等温扩增技术检测鸡传染性支管病毒的方法和检测试剂盒。 

发明内容

本发明的一个目的是解决现有技术中检测鸡传染性支气管炎病毒所需周期长、灵敏度低、现场应用困难等问题，提供一种基于环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplicatio of DNA，简称LAMP)的鸡传染性支气管炎病毒快速检测试剂盒，适用于检测不同血清型的IB病毒，可广泛应用于兽医检测领域。 

为了实现上述目的，本发明采用以下的技术方案： 

本发明由(1)反应液；(2)酶溶液；(3)引物溶液；(4)阳性对照液组成，以上四种液体分别置于容器中。 

优选的，所述引物溶液包括二对特异性引物即内引物、外引物，由浓度为10μM-20μM的内引物、浓度为2μM-4μM的外引物组成； 

引物序列如下： 

内引物1： 

GCTAGATGAACCAGAGGTCCTTCTTTTCCGTTGCTTGGGCTAC 

内引物2； 

GTCACCTCCCCCCACATACCTTTTCGACCTTGTGCGAGAACGTAG 

外引物1：GTTGCTGGTATCACTGCTTGT 

外引物2：CAGGGGTTGTTTGGCACTAC 

进一步优选的，所述引物溶液还包括浓度为5μM-10μM的环引物，序列如下： 

环引物1：CGCCCGTAGGACGCT 

环引物2：GGCTTTTGAGCCTAGCGTTG 

优选的，所述反应液由浓度为100mM-200mM的Tris-HCl(pH8.8)、浓度为50mM-75mM的KCl、浓度为50mM-75mM的(NH4)₂SO4、浓度为4M-5M的甜菜碱、浓度为6mM-8mM的dNTP、浓度为30mM-40mM的MgSO4、浓度为0.01mM-1mM的钙黄绿素锰络合物组成。 

优选的，所述酶溶液由浓度为4U/μL的Bst DNA聚合酶、1.3U/μL的AMV逆转录酶、10U/μL的RNA酶抑制剂组成。 

优选的，所述阳性对照液由阳性模板DNA经体外转录成RNA制备，浓度为10ng/μL-50ng/μL。