[发明专利]基于环介导等温扩增技术的鸡传染性支气管炎病毒快速检测试剂盒及其使用方法

权利要求书

1.一种基于环介导等温扩增技术的鸡传染性支气管炎病毒快速检测试剂盒，其特征在于，由(1)反应液；(2)酶溶液；(3)引物溶液；(4)阳性对照液组成，以上四种液体分别置于容器中。

2.根据权利要求1所述的快速检测试剂盒，其特征在于，所述引物溶液包括二对特异性引物即内引物、外引物，由浓度为10μM-20μM的内引物、浓度为2μM-4μM的外引物组成；

引物序列如下：

内引物1：

GCTAGATGAACCAGAGGTCCTTCTTTTCCGTTGCTTGGGCTAC

内引物2：

GTCACCTCCCCCCACATACCTTTTCGACCTTGTGCGAGAACGT

AG

外引物1：GTTGCTGGTATCACTGCTTGT

外引物2：CAGGGGTTGTTTGGCACTAC

3.根据权利要求2所述的快速检测试剂盒，其特征在于，所述引物溶液还包括浓度为5μM-10μM的环引物，序列如下：

环引物1：CGCCCGTAGGACGCT

环引物2：GGCTTTTGAGCCTAGCGTTG

4.根据权利要求1所述的快速检测试剂盒，其特征在于，所述反应液由浓度为100mM-200mM的Tris-HCl(pH 8.8)、浓度为50mM-75mM的KCl、浓度为50mM-75mM的(NH4)₂SO4、浓度为4M-5M的甜菜碱、浓度为6mM-8mM的dNTP、浓度为30mM-40mM的MgSO4、浓度为0.01mM-1mM的钙黄绿素锰络合物组成。

5.根据权利要求1所述的快速检测试剂盒，其特征在于，所述酶溶液由浓度为4U/μL的Bst DNA聚合酶、1.3U/μL的AMV逆转录酶、10U/μL的RNA酶抑制剂组成。

6.根据权利要求1所述的快速检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照液由阳性模板DNA经体外转录成RNA制备，浓度为10ng/μL-50ng/μL。

7.鸡传染性支气管炎病毒快速检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

[1]RNA模板的制备；

[2]在反应管中加入5μL的反应液、2μL的酶溶液、2μL的引物溶液、RNA模板2μL-5μL，ddH₂O定容至25μL，60℃温育30min-60min；

[3]结果观察：阳性对照管发出黄绿色荧光，样品管与阳性对照同色为阳性，否则为阴性。

8.根据权利要求7所述的鸡传染性支气管炎病毒快速检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述[1]步骤可按以下方式提取：A、取检测组织0.5g，在液氮中研磨3-5min呈粉末，将粉末置于1.5mL离心管中，加入1mLTrizol后，剧烈振荡，室温放置5-10min。

B、加入200μL氯仿，剧烈振荡，室温放置3-5min，12,000g离心15min。

C、吸取上清，加入异丙醇500μL，混匀，室温放置10min。

D、12,000g离心10min，去上清，可见沉淀，用75％乙醇洗涤，缓慢混匀后静置2min。

E、7,500g离心5min，完全去除乙醇，在超净台内用风吹5min后加入8μLddH2O溶解，即为待检RNA，-20℃冰箱中保存备用。

9.根据权利要求7所述的鸡传染性支气管炎病毒快速检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述[1]步骤可按以下方式提取：取咽喉、泄殖腔棉拭子浸泡于300μL生理盐水中10min，12,000g离心15min，取上清200μL，采用(1)中从组织样品中提取RNA的方法提取RNA。