[发明专利]用于复制核酸序列的方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于复制核酸序列的方法。更具体地，本发明涉及用于复 制核酸序列的方法，其中聚合酶反应通过使用具有特定结构的模板核酸序 列作为起始点温育具有DNA聚合酶的反应溶液而进行。

背景技术

在分子生物学研究中，核酸的扩增通常通过使用DNA聚合酶的酶方 法进行。作为用于扩增核酸的方法，聚合酶链式反应(PCR)已被广泛已 知。为了扩增目的靶核酸序列，PCR方法包括以下三个步骤：变性作为模 板使用的双链DNA以将其转化为单链DNA的步骤(变性步骤)；针对所 述单链DNA对引物退火的步骤(退火步骤)；和利用引物作为起始点延长 互补链的步骤(延伸步骤)。在一般的PCR法中，使用热循环仪，且变性 步骤、退火步骤和延伸步骤以不同的温度进行。然而，所述以3种不同温 度类型进行的核酸扩增反应需要复杂的温度控制。而且，PCR法也已经引 起一些问题，因为随着循环次数的增加时间损失也增加。

在前述情况下，已经开发了可以在等温条件下进行的核酸扩增方法。 所述核酸扩增方法的实例包括RCA(旋转循环扩增：Proc.Natl.Acad.Sci (国际科学院学报)，卷92，4641-4645(1995))，ICAN(等温和嵌合引物起 始的核酸扩增)，LAMP(环-介导的等温DNA扩增；Bio Industry(生物工业)， 卷18，第2号(2001))，NASBA(基于核酸序列的扩增法；Nature(自然)，350， 91-(1991))，和TMA(转录介导的扩增法；J.Clin Microbiol(临床微生物学 杂志).卷31，3270-(1993))。

SDA法(日本专利公开(Kokai)号5-130870A(1993))是使用核酸外切酶 的循环测定法，其是一种用于利用聚合酶延长反应扩增靶核酸片段目的位 点的扩增方法类型。这是一种利用与靶核酸片段的所述目的位点特异性杂 交的引物作为起始点进行聚合酶延长反应，并同时，容许5’→3’核酸外切 酶在其上作用，从而从反向分解引物的方法。代替分解的引物，新引物与 该位点杂交，并再用DNA聚合酶进行延长反应。连续周期性重复这种使 用聚合酶的延长反应和随后的使用核酸外切酶解离延长的链的分解反应。 于此，使用聚合酶的延长反应和使用核酸外切酶的分解反应可以在等温条 件下进行。然而，在该方法中，应该使用了核酸外切酶以及聚合酶。因此， 这需要高成本，且还需要设计引物的装置工具。

LAMP方法是扩增靶核酸片段的目的位点的方法，其是近期开发的。 该方法使用互补识别靶核酸片段的至少6个特定位点的至少4种类型的引 物和不具有5’→3’核酸外切酶活性的链置换型Bst DNA聚合酶，并在释 放模板上的双链DNA作为单链DNA的同时催化延长反应，以使得可以在 等温条件下将靶核酸片段的目的位点扩增为特定结构。然而，应该使用了 识别6个特定位点的至少4种类型的引物，且因此非常难以设计所述引物。

ICAN法也是用于扩增靶核酸片段目的位点的方法，其是近期开发的。 这是一种在等温条件下，使用RNA-DNA嵌合引物，具有链置换活性和模 板交换活性的DNA聚合酶，和RNA酶H来扩增基因的方法。在所述嵌 合引物结合模板后，通过DNA聚合酶合成互补链。其后，RNA酶H裂解 嵌合引物-来源的RNA部分，并由裂解位点开始，延长反应伴随链置换反 应和模板交换反应发生。通过重复该反应，扩增基因。然而，该方法也需 要使用特定的引物，即嵌合引物，且因此很难设计该引物。

日本专利公开(Kohyo)号11-509406A(1999)描述在等温条件下，通过 使目的区域内的DNA在存在具有链置换能力的DNA聚合酶的条件下与至 少一对寡核苷酸引物反应而对其进行扩增的方法。然而，日本专利公开 (Kohyo)号11-509406A(1999)中所述的方法已经引起了问题，因为其需要 相当长的反应时间。

日本专利公开(Kokai)号2002-233379描述在等温条件下，通过使目的 区域内的DNA在存在具有链置换能力的DNA聚合酶的条件下与至少一对 寡核苷酸引物反应而对其进行扩增的方法。然而，日本专利公开(Kokai) 号2002-233379中所述的方法已经在显著水平的非特异性扩增产物生成方 面引起了问题。

发明概述