[发明专利]用于复制核酸序列的方法

权利要求书

1.用于复制DNA序列的方法，其包括使用催化链置换互补链合成反 应的聚合酶合成互补链，其中将在两个末端具有由20以上-200以下个连 续核苷酸组成的第一序列及其互补序列的双链模板DNA用作起始点，其 中所述反应是在反应溶液中进行，其中所述方法包括以下步骤：

(a)提供具有这样的结构的双链模板DNA的步骤，其中交替排列由 20以上-200以下个连续核苷酸组成的第一序列及其互补序列和由1以上 -100以下个核苷酸组成的与在模板DNA序列上的第一序列及其互补序列 不同的第二序列及其互补序列，其中所述双链模板DNA的特征是其中存 在至少两个第一序列及其互补序列；

(b)解离步骤(a)中提供的模板DNA的全部或一部分的步骤；

(c)在新DNA链和步骤(b)中获得的全部或部分解离的双链模板 DNA之间通过第一序列及其互补序列形成碱基对的步骤，其中所述新 DNA链由全部或一部分解离的不同双链模板DNA分子提供；或在步骤(b) 中获得的全部或部分解离的双链模板DNA之间通过第一序列及其互补序 列形成碱基对的步骤；和

(d)用催化链置换互补链合成反应的聚合酶合成互补链的步骤，其中 将在步骤(c)碱基配对的一个或两个DNA链的3’-末端用作合成起始点，

其中所有步骤在50℃以上-70℃以下的等温温度下进行。

2.按照权利要求1的方法，其中将在步骤(d)中由链置换互补链合 成反应获得的产物用作步骤(a)中的双链模板DNA。

3.按照权利要求1的方法，其中催化所述链置换互补链合成反应的聚 合酶选自由源自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的5’→3’ 核酸外切酶-缺陷型Bst.DNA聚合酶，源自热坚芽孢杆菌(Bacillus  caldotenax)的5’→3’核酸外切酶缺陷型Bca DNA聚合酶，源自 Termococcus litoralis的5’→3’核酸外切酶缺陷型Vent.DNA聚合酶和源自 酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)的DNA聚合酶组 成的组。

4.按照权利要求1的方法，其中所述反应溶液包括0.01％-1％的非离 子表面活性剂。

5.按照权利要求1的方法，其中所述反应溶液还包括二价阳离子。

6.按照权利要求1的方法，其中所述反应溶液还包括解链温度调节剂。

7.按照权利要求1的方法，其中所有步骤在60分钟内进行。