[发明专利]多核苷酸变体的组合自动化平行合成

说明书

1.技术领域

本公开内容涉及用于有效合成、克隆、转化和筛选多核苷酸变体的大型多样文库的方法，所述多核苷酸变体相对于参考多核苷酸包含明确的(well-defined)核苷酸差异。

2.背景

基于计算机模拟和体外的定向进化蛋白功能的各种技术已经允许产生具有新性质的蛋白。例如，细胞色素P450酶已经被进化为针对正常不被天然存在的酶识别的底物具有活性(参见例如，Landwehr等人，2007，Chem Biol 14(3)：269-78；Kubo等人，2006，Chemistry 12(4)：1216-20.)。通常，为了产生这种新酶，编码参考多肽例如野生型酶的多核苷酸经受诱变以产生编码具有氨基酸序列改变的多肽变体的多核苷酸。针对期望性质例如酶稳定性提高或针对新底物的活性筛选这些变体允许鉴定与改变的性质相关的氨基酸残基。然而，并非所有的突变组合存在于被筛选变体群中。例如，与酶的热稳定性相关的突变可能被发现不与底物特异性改变相关突变相关。这种群体偏差可能源于各种因素，包括但不限于用于诱变的多核苷酸编码的亲本氨基酸序列、多核苷酸体内增殖期间针对组合的可能选择、和用于诱变的技术中的偏差(例如，使用聚合酶而引入错误)。

因为在参考多肽序列的确定的氨基酸残基位置的突变可以提供有关多肽生物活性的大量信息，一旦初始地鉴定了突变，则期望制备可用来测试期望性质的初始的筛选变体组中未发现的突变的各种组合。确定的突变或突变组的基于计算机模拟的选择提供了产生大量可能的突变组合的框架。例如，影响底物特异性的突变可以与影响其他酶性质的突变组合，所述其他酶性质包括但不限于酶活性、热稳定性和抑制剂抗性。通常，产生具有新突变组合的这些多肽的方法是合成个体物类(即，合成编码突变基因的每一个多核苷酸)。这可以通过多核苷酸的化学和/或酶合成结合标准重组技术来完成。这种从头合成技术需要每个多核苷酸变体的完整基因合成和/或大量寡核苷酸引物的合成，所述寡核苷酸引物然后用于合成完整多核苷酸变体(例如，通过ION-PCR)。这些技术需要更多的寡核苷酸合成并导致具有正确序列的变体的较低产量。因此，如果突变数据集很大，产生突变组合的成本和效率可能限制筛选大量新组合的能力。因此，产生编码确定突变的组合的多核苷酸的有效且有成本效率的方法是期望的。

3.概述

本公开内容涉及有效产生与参考多核苷酸序列相比具有确定序列变化(例如，期望的氨基酸突变)的不同组合的多核苷酸的方法。所述方法基于具有重叠相邻区的多核苷酸片段(即，扩增子)文库的使用，使得多核苷酸片段组(sets of the polynucleotide fragments)可以被组装以产生多个多核苷酸变体，每个多核苷酸变体具有确定组的序列变化。使用选定的正向引物和反向引物通过扩增参考多核苷酸模板而引入序列变化，从而产生包括确定的序列变化的多核苷酸片段。所述文库被设计为具有足够的多核苷酸片段以组装至少两个不同的多核苷酸变体序列。在一些实施方案中，多核苷酸片段文库包含与参考序列相比具有所有确定的多核苷酸序列差异(例如，期望的核苷酸变化)的成员，使得可以组装所有序列排列。在一些实施方案中，多核苷酸可以被设计为编码与参考氨基酸序列相比具有确定的氨基酸序列差异的多肽。

本公开的方法能够产生具有确定的核苷酸差异的多核苷酸变体序列的大型文库(例如10、50、100、150、300、500、700、1000或更多变体的文库，每个变体具有1、2、3、5、9、12、15、20、25、30、35、40、50或更多期望的变化)，使用相对少(例如与完整基因合成方法相比)和相对短(例如，35-mer或更短)的寡核苷酸，并且其中正确序列的平均百分比惊人地高(例如，至少65％、75％、85％、95％或更高)。