[发明专利]多核苷酸变体的组合自动化平行合成

权利要求书

1.一种合成多个多核苷酸变体的方法，所述多核苷酸变体的每一个相对于参考多核苷酸序列具有至少一个确定的核苷酸差异，所述方法包括：

(a)用多对正向引物和反向引物的每一对分别扩增参考多核苷酸模板，其中所述多对正向引物和反向引物包括多个确定的核苷酸差异，并且其中每对产生包括能够结合至少一个其他扩增子的相邻重叠序列的序列的扩增子；

(b)分别组装多组扩增子，其中每组包括具有能够结合形成所述参考多核苷酸序列的全长的相邻重叠序列的扩增子；

(c)复制多组组装的扩增子，从而合成多个多核苷酸变体；和

(d)组合所述多个多核苷酸变体。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述多对正向引物和反向引物的每一对包括至少一个确定的核苷酸差异。

3.如权利要求1-2任一项所述的方法，其中所述参考多核苷酸编码参考多肽，并且所述多个多核苷酸变体的每一个编码具有至少一个氨基酸序列差异的多肽。

4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述方法还包括在所述多个多核苷酸变体被组合之前将它们分别克隆入表达载体的步骤。

5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述方法还包括将组合的多个多核苷酸变体克隆入表达载体的步骤，从而产生组合的多个表达载体，每个表达载体包括多核苷酸变体。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述方法还包括用所述组合的多个表达载体转化细胞。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述方法还包括根据所述多核苷酸变体编码的多肽的活性来筛选转化的细胞。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述方法还包括分离所述多核苷酸变体编码的至少一个多肽。

9.如权利要求1-8任一项所述的方法，其中所述多对正向引物和反向引物包括至少一个简并引物。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述简并引物包括在核苷酸差异位置的选自由以下组成的组的至少一个简并密码子：NHT、NNB、NNG、NNK、NNN、NNS、NNT、NDT、RMG、RNG、RRS、SNT、VNS、VNT和VWG。

11.如权利要求9所述的方法，其中所述简并引物包括在核苷酸差异位置的编码20个不同氨基酸的密码子。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述编码20个不同氨基酸的密码子由NNT、VWG和TGG组成。

13.如权利要求1-12任一项所述的方法，其中所述多个多核苷酸变体包括至少20个不同多核苷酸变体。

14.如权利要求1-13任一项所述的方法，其中所述多个多核苷酸变体包括至少200个不同多核苷酸变体。

15.如权利要求1-14任一项所述的方法，其中所述多个多核苷酸变体包括至少1000个不同的多核苷酸变体。

16.如权利要求1-15任一项所述的方法，其中所述多个多核苷酸变体包括至少20个不同多核苷酸变体，每个多核苷酸变体包括在20个不同的选定位置之一的不同的确定的核苷酸差异。

17.如权利要求16所述的方法，其中至少75％的合成的多个多核苷酸变体包括正确序列。

18.如权利要求1-17任一项所述的方法，其中所述多个多核苷酸变体包括至少46个不同的多核苷酸变体，每个多核苷酸变体包括在2个不同选定位置之一的23个不同密码子之一。

19.如权利要求18所述的方法，其中至少75％的合成的多个多核苷酸变体包括正确序列。

20.如权利要求1-19任一项所述的方法，其中所述多个多核苷酸变体包括至少460个不同的多核苷酸变体，每个多核苷酸变体包括在20个不同选定位置之一的23个不同密码子之一。

21.如权利要求20所述的方法，其中至少75％的合成的多个多核苷酸变体包括正确序列。

22.如权利要求1所述的方法，其中所述多组扩增子的至少一组包括至少5个不同的简并扩增子。

23.如权利要求1-22任一项所述的方法，其中所述正向引物和反向引物的长度是约20至约50核苷酸。