[发明专利]在来源于CHO细胞的糖蛋白产物中的含有半乳糖-α-1,3-半乳糖的N-聚糖

说明书

发明领域

本发明涉及用于检测从哺乳动物细胞表达系统表达的蛋白质中的特殊聚糖结构的方法和材料。

发明背景

在哺乳动物细胞培养物例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中生产了许多重组治疗性生物药物产品。哺乳动物细胞培养物与其他表达系统(例如酵母和原核系统)相比是优选用于生产重组糖蛋白的，主要是因为哺乳动物细胞培养物产生具有糖基化模式的糖蛋白，通常这些糖基化模式是被人类识别和耐受的。

末端α-连接的半乳糖(gal-α-1，3-gal)连接的潜在不利影响是已知的(Chung et al.，N Engl J Med，358：11(2008))。以前已经报道这类末端α-gal连接在由中国仓鼠卵巢(CHO)细胞所产生的重组糖蛋白中是不存在的。例如，尽管在NSO(一种从鼠类开发的骨髓瘤细胞系)中产生的抗CDw52抗体(坎帕斯，Campath)包括潜在免疫原性的糖型，这些糖型具有非还原性末端α-连接的半乳糖残基，由CHO细胞产生的坎帕斯主要包含3种糖型，这些糖型与正常的人类IgG是一致的(Sheeley et al.，Analytical Biochemistry 247：102-110(1997))。

发明概述

本发明部分地是基于以下发现，即由重组CHO细胞产生的糖蛋白包含具有末端半乳糖-α-1，3-半乳糖连接的聚糖结构，这可能对于将这类糖蛋白用于治疗性目的具有有害影响。例如，将具有末端α-gal连接的糖蛋白施用于人类用于治疗性目的可以导致在患者体内形成针对该重组糖蛋白的单克隆抗体，这样使得随后的给药变得效果更低或甚至在该患者体内引起不利的超敏反应。

与上述传授的内容相反，诸位申请人令人惊奇地发现在CHO细胞培养物中产生的大部分的重组糖蛋白可以展示出末端gal-α-1，3-gal连接的存在，表明对于施用于患者的蛋白和肽基产物发生不良反应的可能性。

本发明提供了对于生产和分析来自CHO细胞的重组糖蛋白有用的多种化合物和方法以及包含这类糖蛋白的组合物，其中这些糖蛋白包括调节(例如，减少或在一些情况下增加)水平的末端gal-α-1，3-gal连接。

因此，在一个第一方面，本发明包括用于对中国仓鼠卵巢(CHO)细胞群进行评估的方法。在某些实施方案中，该检测方法包括：

(a)提供来自该群的一个或多个CHO细胞；并且

(b)对包含由所述细胞生成的末端半乳糖-α-1-3-半乳糖残基的聚糖进行测量，其中这些CHO细胞还没有被基因工程化以表达α-半乳糖苷转移酶编码序列。

该测量步骤可以包括以下各步骤的任何步骤：(a)分离由这些细胞所产生的糖蛋白并且测量在这些糖蛋白上的包含末端半乳糖-α-1-3-半乳糖残基的聚糖，(b)分离由这些细胞所产生的特异性糖蛋白成分并且测量在该分离的糖蛋白成分上的包含末端半乳糖-α-1-3-半乳糖残基的聚糖，(c)从由这些细胞所产生的糖蛋白中分离聚糖，并且测量在这些分离的聚糖中的包含末端半乳糖-α-1-3-半乳糖残基的聚糖，(d)从在糖蛋白或该一个或多个CHO细胞上存在的聚糖切割单糖，并且检测来自这些切割的单糖的末端释放α-半乳糖残基，(e)从来自于由这些细胞产生的糖蛋白提供至少一种肽，并且测量该至少一种肽上的包含末端半乳糖-α-1-3-半乳糖残基的聚糖，(f)通过测量在该一个或多个CHO细胞的细胞表面上的聚糖对该糖蛋白上的包含末端半乳糖-α-1-3-半乳糖残基的聚糖的相对水平进行测量。用来测量末端gal-α-1，3-gal连接的技术可以包括以下方法中的一种或多种，以及这些方法的任何一种的组合：色谱方法、质谱(MS)法、电泳法(例如，毛细管电泳)、核磁共振(NMR)法、单糖分析、荧光法、UV-VIS吸收法、酶法、以及检测分子(如一种抗体或凝集素)的使用。

用于步骤2的测量的聚糖的来源可以是选自下组，该组由下列各项组成：CHO细胞群；在这些CHO细胞的表面上表达的糖蛋白或聚糖；通过切割在CHO细胞群中的细胞的表面上存在的蛋白质而得到的肽；在CHO细胞群的表面上存在的聚糖；由CHO细胞群所分泌或表达的糖蛋白、由一个CHO细胞或一个CHO细胞群所表达的分离的糖蛋白表达产物；来源于由一个CHO细胞或一个CHO细胞群所表达的分离的蛋白表达产物的肽；或来源于由一个CHO细胞或直接地由一个CHO细胞群所表达的分离的蛋白表达产物的聚糖。在一些实施方案中，该方法包括用一种或多种外切糖苷酶(包括α-半乳糖苷酶)来处理聚糖或糖蛋白的一种来源，随后对该聚糖群进行分析。