[发明专利]制备能够形成包含体的蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及制备一种表达于原核细胞时形成包含体的蛋白(下文称作“包含体形成蛋白”)的方法和用于该方法的核酸片段。更具体地，本发明涉及制备包含体形成蛋白的方法，包括步骤：(1)制备一种包含核酸片段的表达载体，该核酸片段由编码修饰的信号肽的核苷酸序列和结合于其下游的编码目的蛋白的核苷酸序列组成，(2)制备所述表达载体转化的产生包含体形成蛋白的宿主细胞和(3)从培养产生包含体形成蛋白的宿主细胞获得的培养物纯化包含体形成蛋白；本发明还涉及上述(1)的核酸片段。

目的蛋白最好优选基质金属蛋白酶7(下文称作“MMP-7”)。因此，本发明最优选的实施方案涉及包含编码修饰的信号肽的核苷酸序列和编码原基质蛋白酶7(下文称作“proMMP-7”)的核苷酸序列的核酸片段，以及一种通过使用所述核酸片段制备MMP-7的方法。

背景技术

当蛋白在革兰氏阴性细菌如大肠杆菌(E.coli)中产生时，目的蛋白常会因为在该蛋白的N端连接有信号序列而分泌入内膜(细胞膜)和细胞壁之间的间隙(称作外周胞质)中。但是，穿过内膜传送目的蛋白进入外周胞质的效率根据信号序列和目的蛋白组合而不同，而且没有始终高传送的已知方法。已知蛋白水解酶(蛋白酶)也分泌入大肠杆菌的外周胞质，因此分泌进入外周胞质的目的蛋白可能会被水解。

另一方面，当目的蛋白在变性的情况下分泌进入外周胞质时，蛋白有时会形成一种叫做包含体的结构。一般认为包入包含体的目的蛋白不会被蛋白酶水解。此外，由于包含体包入了高浓度的目的蛋白，因此从纯化效率和高得率回收来看它是有优势的。不过，已知目前没有在革兰氏阴性细菌如大肠杆菌里表达目的蛋白并通过例如修饰信号肽高效形成包含体的方法。

Ibrahim等表明利用的麦芽无细胞蛋白合成系统，用脯氨酸置换大肠杆菌内毒素亚单位B信号序列的疏水性核心区域P8位的亮氨酸，切割信号序列被阻止，而且合成效率增加了2倍(参考例如非专利文献1)。不过，因为该方法的结果来自简化的无细胞系统的表达系统，所以不一定适用于活细胞例如大肠杆菌的表达系统。另外，用此方法合成的蛋白是可溶性的，不会形成包含体。

另外一篇研究报道了当大肠杆菌的核糖体结合蛋白的信号序列自然地发生突变(P17位的亮氨酸突变成脯氨酸)时，切割信号序列被阻止，可溶的核糖体结合蛋白前体积累于细胞质，但它的表达量非常低以至于需要利用同位素标记来检测，等于突变前的野生型的蛋白表达水平(参考例如非专利文献2)。因此，原核细胞信号序列的突变对于大肠杆菌表达包含体的影响还不是非常清楚，特别是，突变对于表达真核细胞结构基因的影响完全未知。

当整合了外源基因的重组细胞用于产生蛋白时，如果不用含有抗生素的选择性培养基，重组细胞在繁殖时会排斥该整合的基因，从而丢失该基因的特征，此种细胞压倒性的繁殖后导致产生蛋白的效率降低。因此，当基因(例如表达质粒)导入宿主细胞时，通过降解或者修饰抗生素用于选择的提供抗生素抗性的基因也会同时导入宿主细胞，细胞培养会采用含有对没有携带所述基因的宿主细胞有毒的抗生素(例如氨苄青霉素和四环素)的选择性培养基，进而允许选择那些携带了该基因的重组细胞，抑制那些排斥导入基因的重组细胞的繁殖。

不过，抗生素可能对活体生物有毒和引起药物超敏感性(过敏)。相应地，对于制造和销售使用重组细胞的药物、动物药或者食品，其抗生素的污染都应该受到严格的控制。因此，业界需求无需抗生素选择的保持导入基因的规则(constitution)和方法。

MMP-7是基质金属蛋白酶(下文称作“MMP”)，属于锌分子位于活性位点的锌型金属蛋白酶家族(参考例如非专利文献3)。MMP以前体产生。当分泌到细胞外时，前体加工切除信号序列，然后加工切除原序列而产生活性形式。据报道胞外分泌的MMP参与胞外基质的代谢，而MMP-7主要由癌细胞分泌，参与癌症的浸润和转移(参考例如非专利文献4)。和其他MMP不同，MMP-7不具有铰链域和血红素结合蛋白样域，在MMP中间其由最少分子单位组成，其底物为胶原和构成胞外基质的组分例如纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白和聚集蛋白聚糖。