[发明专利]失活谷氨酰胺合成酶基因表达的方法和组合物

说明书

根据联邦政府资助的研究对发明权的声明

不适用。

技术领域

本发明涉及基因组工程、细胞培养、细胞系产生和蛋白制备的领域。

背景技术

谷氨酰胺合成酶(GS)是氨基酸L-谷氨酰胺合成中的关键酶。见，Meister，A.in Glutamine Metabolism，Enzymology and Regulation(eds.J.Mora & R.Palacios)1-40(Academic Press，N.Y.；1980)。因此，GS阴性细胞系对L-谷氨酰胺是营养缺陷型的。虽然缺乏GS阴性CHO细胞系情况下需要使用GS抑制剂甲硫氨酸磺基肟来实现选择，但GS常常被用作CHO细胞基重组蛋白表达系统的选择标记基因(Wurm et al.(2004)Nature Biotechnology 22：1393-1398)。

此外，二氢叶酸还原酶(DHFR，5，6，7，8-四氢叶酸：NADP+氧化还原酶)是真核生物和原核生物中的必需酶，并催化二氢叶酸NADPH依赖性还原为四氢叶酸，其是胸苷酸、嘌呤核苷酸、甘氨酸和甲基化合物生物合成中一碳单位的必需载体。

DHFR缺陷型细胞早已被用于重组蛋白的制备。DHFR缺陷型细胞只会在补充有包含叶酸代谢的某些因子或DHFR被提供给该细胞(例如作为转基因)的培养基中生长。通过在未补充培养基中培养细胞可以选择DHFR转基因已被稳定整合的细胞。此外，当使用单一多核苷酸引入细胞时，外源性序列一般是共整合的。因此，当DHFR转基因也包括编码目标蛋白的序列时，选定的细胞将都表达DHFR和目标蛋白。此外，在应对抑制剂，如甲氨蝶呤(MTX)时，DHFR基因的复制数可以被扩增。因此，与外源性DHFR共整合的编码目标蛋白的序列，可以通过逐步与该细胞接触被扩增，以增加甲氨蝶呤的浓度，从而造成目标重组蛋白的过度表达。然而，尽管重组蛋白表达的DHFR缺陷型细胞系统的广泛应用，当前可用的DHFR缺陷型细胞及其衍生的亲本DHFR感觉态细胞不会生长。

因此，单基因和多基因敲除的哺乳动物细胞在研究(药物研发和细胞疗法)中具有巨大的效用。然而，靶向删除研究者指定基因的传统方法依赖于同源重组或基因打靶的过程。Mansour et al.(1988)Nature 336：348-352；Vasquez et al.(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98：8403-8410；Rago et al.(2007)Nature Protocols 2：2734-2746；Kohli et al.(2004)Nucleic Acids Research 32，e3。虽然对多种细胞类型能够产生确定的等位基因敲除，这种技术已被证明效率太低，从而日常应用也很费力。见，例如，Yamane-Ohnuki et al.(2004)Biotechnol Bioeng 87：614-622。这些靶向基因删除方法需要同源重组及药物选择的连续循环，以隔离罕见的所需事件-这一过程相当费力，以限制应用于个别基因位点。因此，多个靶基因位点修饰的哺乳动物细胞系的产生还有待于开发。