[发明专利]失活谷氨酰胺合成酶基因表达的方法和组合物

权利要求书

1.一种包含如表1所示的4、5或6个锌指识别区域的锌指DNA结合域。

2.一种包含根据权利要求1所述锌指DNA结合域和至少一种切割域或至少一种切割半域的融合蛋白。

3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中所述切割半域是野生型或工程化FokI切割半域。

4.一种编码根据权利要求1至3中任一项所述锌指DNA结合域或融合蛋白的多核苷酸。

5.一种包含根据权利要求1至3中任一项所述蛋白或根据权利要求4所述多核苷酸的分离的细胞。

6.一种细胞系，其中谷氨酰胺合成酶(GS)是通过核酸酶部分或全部失活的。

7.一种使细胞中内源性细胞GS基因失活的方法，所述方法包括：

(a)将编码第一多肽的第一核酸引入细胞，其中所述第一多肽包含：

(i)工程化以与内源性GS基因中的第一靶位点结合的锌指DNA结合域；以及

(ii)切割域；使得所述多肽在所述细胞中表达，从而所述多肽与所述靶位点结合，并切割所述GS基因。

8.根据权利要求7所述的方法，进一步包括引入编码第二多肽的核酸，其中所述第二多肽包含：

(i)工程化以与所述GS基因中的第二靶位点结合的锌指DNA结合域；以及

(ii)切割域；使得所述第二多肽在所述细胞中表达，从而所述第一和第二多肽与它们各自的靶位点结合，并切割所述GS基因。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述第一和第二多肽是由相同核酸或不同核酸编码的。

10.根据权利要求7至9中任一项所述的方法，进一步包括使所述细胞中DHFR基因失活。

11.根据权利要求7至10中任一项所述的方法，进一步包括使所述细胞中FUT8基因失活。

12.一种在宿主细胞中制备目标重组蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)提供包含内源性GS基因的宿主细胞；

(b)通过权利要求7至10中任一项所述的方法使所述宿主细胞的所述内源性GS基因失活；以及

(c)将包含转基因的表达载体引入所述宿主细胞，所述转基因包含编码目标蛋白的序列，从而制备所述重组蛋白。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述目标蛋白包含α1抗胰蛋白酶或单克隆抗体。

14.一种其中GS基因部分或完全失活的细胞系，其中所述细胞系是通过以下步骤制备的：

(a)根据权利要求7至10中任一项所述的方法使细胞中所述GS基因失活；以及

(b)在适于产生其中所述GS基因部分或完全失活的细胞系的条件下培养所述细胞。

15.根据权利要求14所述的细胞系，其中所述细胞是选自由COS细胞、CHO细胞、VERO细胞、MDCK细胞、WI38细胞、V79细胞、B14AF28-G3细胞、BHK细胞、HaK细胞、NS0细胞、SP2/0-Ag14细胞、HeLa细胞、HEK293细胞、和perC6细胞组成的组的哺乳动物细胞。