[发明专利]纤维素酶CEL5H相关试剂及其在微生物中的应用

说明书

发明领域

本发明涉及生物技术和遗传工程的领域，并且特别地关注借助于合适的酶试剂和表达所述酶试剂的微生物利用纤维素和木质素纤维素材料的策略。更特别地，本发明涉及Saccharophagus degradans的纤维素酶Cel5H和其同源物、功能片段和/或变体在产溶剂微生物(solventogenic microorganism)的背景中的应用，以及涉及来源于Cel5H和其同源物的新结构域和试剂。

发明背景

纤维素和木质素纤维素材料是植物生物量的主要成分，并且其中发现的纤维素聚合物可以提供大量的葡萄糖或其他可发酵的单糖或寡糖的来源，它们可以随之被产溶剂微生物代谢以产生有用的溶剂，诸如乙醇、丙酮或丁醇。

纤维素聚合物可以被纤维素解聚酶水解，所述纤维素解聚酶通常被称为纤维素水解酶(cellulolytic enzyme)或纤维素酶。例如，天然纤维素的水解主要涉及4种类型的纤维素酶：纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase)(1，4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶，EC 3.2.1.91)，内切-β-1，4-葡聚糖酶(内切-1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，EC 3.2.1.4)，内切-加工性(processive)纤维素酶(EC 3.2.1.4./3.2.1.91)，和β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)。纤维素酶和相关的酶已经广泛地用于生物技术的各个领域包括食品，啤酒，葡萄酒，动物饲料，纺织品和洗涤品，纸浆和纸工业，农业生产和其他领域(关于综述参见Bhat 2000.Biotechnical Advances(生物技术进展)18：355-383)。

纤维素酶的性质可以不同，诸如尤其是，它们可以充当内切葡聚糖酶或加工性外切葡聚糖酶，它们可以产生多种长度的单体或低聚体，它们可以具有水解不同的纤维素形式诸如结晶纤维素、半结晶纤维素、无定形纤维素或半纤维素的不同能力，它们可以进一步显示结合纤维素物质的不同的强度，不同的动力学参数等。因此，需要投入大量的努力来进一步表征纤维素酶，从而鉴定其功能部分或结构域，这些功能部分或结构域可能是这些酶的感兴趣的特性的基础。这样的功能结构域可以有利地与其他纤维素酶或其结构域组合以产生具有所需活性的嵌合酶。

此外，在产溶剂微生物中重组表达纤维素酶，从而允许通过这些微生物直接从含纤维素材料中生产有用的溶剂包括，尤其是乙醇尚未得到满意的进展。为了实现进一步的改进，需要识别、表征和选择特别适合用于此类应用或在此类应用中有利的纤维素酶。

Saccharophagus degradans 2-40株以前已知为Microbifulber degradans 2-40株，并且在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)中以ATCC 43961的保藏号保藏，其是一种能够降解至少10种不同的复杂多糖包括尤其是纤维素的海洋γ-变形菌(proteobacterium)(Andrykovitch & Marx 1988.Appl Environ Microbiol(应用与环境微生物学)54：3-4；Ensor等.1999.J Ind Microbiol Biotechnol(工业微生物学和生物技术杂志)23：123-126)。

S.degradans基因组已经被测序并且其纤维素酶系统也被鉴定，其中包括被称为Cel5H的纤维素酶(Taylor等2006.J Bacteriol(细菌学杂志)188：3849-61)。此外，US2007/0292929一般性地设想包括表达来自S.degradans的纤维素降解蛋白的产乙醇(ethanologenic)细菌的重组微生物。然而，仅证明了由S.degradans表达的酶的活性，且不清楚当在产乙醇细菌中表达时这些酶的任一种是否将适当地发挥作用。

发明概述

本发明人已经对S.degradans 2-40株的Cel5H纤维素酶的结构和活性进行了充分的表征并且已经结论性地确定Cel5H对结晶纤维素显示较高的活性。因此，Cel5H有利于在产生溶剂的(产溶剂)微生物，更特别地在产乙醇微生物诸如梭菌属(Clostridium species)的产乙醇细菌包括丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)中的异源制备。因此，Cel5H在这些微生物中的表达(和任选地分泌)使它们能够在包含或富含结晶、半结晶或无定形纤维素的纤维素物质上生长，从而允许从含纤维素的物质中直接产生有用的溶剂诸如乙醇。