[发明专利]使用酶促反应和偶联反应的肽合成

说明书

本发明涉及用于酶促合成肽的方法。

肽(尤其是寡肽)具有许多应用，例如用作药物、食物或饲料成分、农用化学品或化妆品成分。

就本发明的目的而言，肽表示两个或更多个氨基酸的任何链。就本发明的目的而言，“寡肽”表示基于2-200个氨基酸、尤其基于2-100个氨基酸、更尤其基于2-50个氨基酸的肽，优选地为2-200个氨基酸、更优选地为2-100或2-50个氨基酸的任何线性链。术语“多肽”用于表示与针对寡肽所规定的数量相比基于更大数量的氨基酸的肽。

化学-酶促肽合成就本发明的目的而言被定义为其中一个或多个肽键通过酶促偶联反应形成的肽合成，其具有优于化学肽合成的若干优点。例如，由于不需要或仅需要有限的氨基酸侧链保护，在大规模生产情况下的成本价格更低。另外，该方法对环境更加友好。例如，不需要化学计量用量的毒性化学试剂如二环己基碳二亚胺(DCC)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺甲碘化物(EDCI)。另外，这类方法可以使用更少的有机溶剂进行。另外，酶催化的偶联没有外消旋化(见例如Sewald和H.-D.Jakubke，“Peptides：Chemistry and Biology”，第1次重印，Ed.Wiley-VCH Verlag GmbH，Weinheim 2002，第250页)，导致更纯的产物和/或更容易的分离。

对化学-酶促偶联方法而言，有两种产生肽键的途径。在所谓的热力学(或平衡控制的)途径中，羧基组件(即要在其C-端偶联的组件)带有游离的羧酸官能度，而在动力学控制的途径中使用活性羧基组件，例如主要的n-烷基酯。

热力学途径具有三种主要的缺点：i)平衡通常位于肽键切割一侧，从而偶联产率较低；ii)通常需要大量酶；iii)反应速率通常非常低。在动力学控制的途径中，需要烷基酯作为起始材料，但是需要少得多的酶，反应时间显著更短，并且最重要的是，可获得的最大产率通常显著更高。因此对工业应用而言，基于动力学途径(即使用活化的羧基组件)的酶促肽合成概念是最有吸引力的(见例如N.Sewald and H.-D.Jakubke，in：“Peptides：Chemistry and Biology”，第1次重印，Ed.Wiley-VCH Verlag GmbH，Weinheim 2002，第4.6.2节)。

化学-酶促肽合成可以以C→N端方向或者以N→C端方向进行，但是也可以包括下述片段的酶促偶联，所述片段单独地使用化学合成被合成，或者通过化学和化学-酶促偶联步骤的组合被合成。Chen et al.描述了在“低水性”(low aqueous)有机溶剂中使用在所述有机溶剂中有活性并且稳定的蛋白酶的偶联(J.Org.Chem.1992，57，6960-65，Biomed.Biochim.Acta 1991，50，181，Bioorg.Med.Chem.Lett.1991，1，445)。在这些出版物中描述的方法的缺点是在低水性条件下几乎没有一种酶是有活性且稳定的，并且酶具有有限的底物范围。因此，通常需要长的反应时间和大幅过量的氨基酸或肽亲核体。有时在肽中的其他位置上仍然存在一些水解，并且通常转酰氨基反应发生在片段之一中现存的肽键上(即现存肽键之一上氨基酸或肽亲核体的酶催化的亲核攻击)。因此，产率有时较低。另外，产物的纯化通常是困难的。