[发明专利]使用酶促反应和偶联反应的肽合成

权利要求书

1.用于酶促合成肽的方法，所述方法包括由以下(i)和(ii)酶促制备酯或硫酯：(i)N-端受保护的氨基酸、N-端受保护的氨基酸C-端酯、N-端受保护的肽、或N-端受保护的肽C-端酯，和(ii)式HO-CX₂-Z所表示的醇、或式HS-CX₂-Z所表示的硫醇，

每个X独立地表示卤素原子或氢原子；且Z选自下组：包含至少两个取代基的sp³-杂化的碳，所述取代基包含和sp³-杂化的碳直接连接的杂原子，和包含一个或两个取代基的sp²-杂化的碳，所述取代基包含和sp²-杂化的碳直接连接的杂原子，

酯或硫酯的制备在以反应介质中液体重量为基础包含2重量％或更少水的反应介质中进行；和

将制备得到的酯或硫酯与任选地C-端受保护的氨基酸或与任选地C-端受保护的肽酶促偶联，从而在以反应介质总重为基础包含2重量％或更少水的反应介质中合成肽。

2.根据权利要求1的方法，其中所述偶联在存在用于催化所述酯或硫酯的制备的酶时进行。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述酯或硫酯的制备或所述偶联由至少一种选自脂肪酶、酯酶和蛋白酶的酶催化。

4.根据权利要求3所述的方法，其中使用蛋白酶和选自脂肪酶和酯酶组的酶，其中至少这些酶之一催化所述酯或硫酯的制备，其他酶至少催化所述偶联。

5.根据权利要求3所述的方法，其中所述酯或硫酯的制备以及所述偶联均由选自脂肪酶、酯酶和蛋白酶组的单一酶催化。

6.根据权利要求3-5中任一项所述的方法，其中使用选自以下脂肪酶的组的脂肪酶，所述脂肪酶来自假丝酵母，优选地来自南极假丝酵母，尤其是南极假丝酵母脂肪酶B。

7.根据权利要求3-6中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶选自下组：丝氨酸型羧肽酶，金属羧肽酶，半胱氨酸型羧肽酶，丝氨酸内肽酶，半胱氨酸内肽酶，天冬氨酸内肽酶和金属内肽酶。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述蛋白酶是选自枯草杆菌蛋白酶组的丝氨酸内肽酶，优选地是枯草杆菌蛋白酶Carlsberg。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用至少一种被固定的酶。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述酯的制备和所述偶联在下述反应介质中进行，所述反应介质包含1.0重量％或更少水，尤其是0.5重量％或更少水，更尤其是0.1重量％或更少水。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中Z是氨基甲酰基、三氟甲基或三氯甲基。

12.根据前述权利要求中任一项的方法，其中两个X均表示氢。

13.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述酯或硫酯的制备在存在以下物质时进行：要与所制备的酯或硫酯偶联的任选地C-端受保护的氨基酸或任选地C-端受保护的肽，和催化所述偶联反应的酶。

14.根据权利要求1-12中任一项的方法，其中在制备了所述酯或硫酯之后添加所述任选地C-端受保护的氨基酸或任选地C-端受保护的肽。

15.根据前述权利要求中任一项的方法，其中进行所述偶联时不首先从所述反应介质中分离所述制备得到的酯或硫酯。