[发明专利]用于乙醇生产的孢子形成缺陷嗜热微生物

说明书

技术领域

本发明涉及适于生产乙醇的微生物的生产。本发明具体地涉及为用于防止孢子形成的微生物修饰。

背景技术

孢子形成是一个多阶段的发育过程，负责使生长细胞转变为被称作孢子或内生孢子的休眠细胞类型。孢子适于在不利条件下散布并且生存很长时间，还构成很多植物、藻类和细菌(如芽孢杆菌属种)生活周期的一部分。

进入孢子形成过程的主要调节蛋白是DNA结合蛋白Spo0A(阶段0的孢子形成蛋白A)，它是转录因子的反应调节蛋白家族(response regulator family)的成员。各种其他基因——包括编码5种组氨酸自身激酶(KinA、KinB、KinC、KinD和KinE)和2种反应蛋白(Spo0B和Spo0F)的基因——也参与控制孢子形成的启动(Molle et al.；Mol.Microbiol.；2003，50(5)：1683-1701)。Spo0A的活性由多组分磷酸接力传递(phosphorelay)控制，所述磷酸接力传递识别并且整合环境信号以启动孢子形成(Trach KA，et al；Mol.Microbiol.1993；8(1)：69-79)。当Spo0A-P的调节N-末端结构域磷酸化时，Spo0A-P与被称为“0A-盒”的DNA序列元件结合，所述0A-盒激活参与孢子形成的基因。Spo0A的C-末端结构域的缺失(没有活性，直到N-末端被磷酸化)已被证明导致孢子形成阴性表型(Rowe-Magnus DA，et al；J.Bacteriol.；2000；182(15)：4352-4355)。

还已发现Spo0A会直接或间接地影响枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中超过500个基因的表达的活化或抑制，并且因此通过受它控制的调节基因间接介导基因转录的整体模式(Molle et al.；Mol.Microbiol.；2003，50(5)：1683-1701)。

孢子形成受分解代谢物的抑制，由此葡萄糖或其他易代谢的碳源的存在会抑制野生型细胞的孢子形成。具体地，已知葡萄糖会抑制spo0A和spo0F的转录(Myseliwiec，TH et al；J.Bacterial.；1991；173(6)：1911-1919)。

在商业发酵过程中，由于两个主要原因孢子是不合需要的，所述原因为：

1.孢子形成暂停了生物的活性代谢(active metabolism)，导致所需代谢产物的形成的减少或终止；并且

2.形成孢子的微生物更难处理和控制防范，因此需要因环境原因(包括健康和安全)避免商业过程微生物的存活，并且还需要防止商业菌株不受控地释放。

细菌代谢合适底物的一般过程是糖酵解，所述糖酵解是将葡萄糖转化为丙酮酸并且产生ATP的一系列反应。代谢能量产生过程中丙酮酸的归宿因微生物和环境条件而不同。丙酮酸的4个主要反应在图5中显示。

首先，在有氧条件下，很多微生物会利用柠檬酸循环以及丙酮酸向乙酰辅酶A的转化(由丙酮酸脱氢酶(PDH)催化)产生能量。

第二，在厌氧条件下，一些产乙醇生物能通过将丙酮酸脱羧转化为乙醛(由丙酮酸脱羧酶(PDC)催化)并且随后通过用NADH将乙醛还原为乙醇(由醇脱氢酶(ADH)催化)来进行成醇发酵(alcoholic fermentation)。

第三个反应也发生在厌氧条件下，是将丙酮酸转化为乙酰辅酶A，由丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)催化。乙酰辅酶A随后被乙醛脱氢酶(AcDH)转化为乙醛，乙醇是通过还原乙醛(由ADH催化)产生。

第四个过程是丙酮酸转变为乳酸，这通过乳酸脱氢酶(LDH)的催化发生。

将微生物用于生产乙醇备受关注，其中使用在自然条件下进行厌氧发酵的微生物或使用整合了丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶基因的重组微生物。

WO2008/038019公开了包含使天然LDH和PFL基因失活并且上调PDC、PDH和ADH基因以促进乙醇形成的修饰的微生物。

需要进一步改善用微生物进行的乙醇生产。

发明内容

本发明基于这样一个意外的发现，即对孢子形成嗜热微生物中spo0A基因的抑制导致所述微生物的乙醇耐受性增强，并且代谢也增强，这致使代谢终产物(如乙醇)的生产率提高。

根据本发明的第一个方面，嗜热微生物包含与野生型相比使孢子形成减少的修饰，其中第一个修饰使天然spo0A基因失活。