[发明专利]基于ADP检测的发光磷酸转移酶或ATP水解酶测定

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求于2008年7月22日申请的美国专利申请顺序号61/082,775和2009年4月17日申请的美国专利申请顺序号61/170,308和2009年5月29日申请的美国专利申请顺序号61/182,372的权益，这些申请的公开内容通过引用结合到本文中

背景

因为转移酶、尤其是激酶的生理相关性、多样性和普遍存在，它们成为生化和医学研究中最重要并被广泛研究的一类酶家族。研究表明蛋白激酶和脂质激酶是许多细胞功能的关键性调节剂，所述功能包括信号转导、转录调节、细胞运动、细胞分裂以及细胞对药物、毒素和病原体的反应。

蛋白激酶在多种细胞事件的调节中起到至关重要的作用。这些酶的作用是通过将磷酸残基转移至某些胞内多肽的氨基酸，使这些蛋白质底物活化并发动包括生长、分化和细胞分裂在内的活化控制事件级联。在肿瘤生物学领域已经深入研究了蛋白激酶。据信，细胞中激酶受控活性的缺失导致形成肿瘤。制药业一直在研究靶向这些激酶的药物，以有助于治疗各种肿瘤。有超过500种蛋白激酶(大约占2-2.5％的人类基因组)涉及细胞功能的调节。它们以跨膜酶和胞质溶胶酶形式存在，并且它们使丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸氨基酸残基磷酸化。根据这样的底物特异性，可将激酶分为2组：丝氨酸/苏氨酸激酶和酪氨酸激酶。

丝氨酸/苏氨酸激酶包括环状AMP和环状GMP依赖型蛋白激酶、钙和磷脂依赖型蛋白激酶、钙和钙调蛋白依赖型蛋白激酶、酪蛋白激酶、细胞周期蛋白激酶等。这些激酶通常是胞质酶或可能通过锚定蛋白与特定细胞部分缔合。

酪氨酸激酶使酪氨酸残基磷酸化。这些特定激酶的存在数量非常少，但在细胞调节中却起到同样重要的作用。这些激酶包括某些可溶性酶例如蛋白激酶src家族和生长因子受体，例如表皮生长因子受体、胰岛素受体、血小板衍生的生长因子受体等。研究表明，许多酪氨酸激酶是跨膜蛋白，其受体结构域位于胞外，而其激酶结构域在胞内。

脂质激酶在胞内信号转导中也起到重要作用，可以分为4大类。示例性的脂质激酶包括PI3激酶和磷脂酰肌醇4-激酶。

糖激酶和其它磷酸转移酶在细胞代谢、增殖和细胞凋亡中也起到主要作用。

因为磷酸化事件涉及如此之多的细胞功能和疾病，所以鉴定激酶活性就特别重要。目前用于检测激酶活性的测定类型包括荧光共振能量转移(FRET)测定、荧光偏振(FP)测定和基于放射性的测定例如闪烁亲近测定(SPA)。用于检测激酶活性的FRET测定是利用与荧光分子连接的蛋白质或肽底物和另一荧光标记的探针。这两个荧光分子仅当底物被磷酸化并被标记探针识别后，才会邻近。因此，当被激酶磷酸化时，标记的能量通过共振传递给荧光分子(受体)。能量从较高能量供体荧光团直接传递到较低能量受体分子的能力，导致受体分子的敏化荧光并同时猝灭供体荧光。在此情况下，供体荧光因邻近受体被“猝灭”，而供体能量以非放射性方式传递给受体。依照福斯特方程，能量转移效率取决于供体和受体生色团之间的距离。在大多数情况下，在距离大于100埃时，未观察到FRET，因此FRET的存在是邻近的良好指示。因此，在利用与荧光分子连接的蛋白质或肽底物和另一荧光标记的探针而检测激酶活性的FRET测定中，如果激酶被抑制，两个荧光分子仍然分开，则不发生FRET。

基于FRET的测定有很多缺陷，包括大量的假命中，例如因为对所测化合物的荧光干扰、狭窄的动态范围和测定所用抗体相关的表现情况。

FP测定是基于高亲和力结合剂(例如抗体、螯合原子等)与荧光标记分子的结合。例如，与磷酸化荧光标记肽结合、而不与非磷酸化荧光标记肽结合的抗体可用于激酶测定。其它方法利用与ADP(其它激酶反应的产物)结合的荧光标记抗体监测激酶活性。当荧光标记被平面偏振光激发，就以同一偏振面发射光，只要荧光标记在整个激发态保持稳定(激发态的持续时间随荧光团的不同而不同，对于萤光素(fluoroscein)为4毫微秒)。如果偏振光用于激发荧光团，可同时在与偏振面平行的平面(激发面)和与偏振面垂直的平面上监测发射光强度。FP测定需要能够以高特异性与荧光标记分子结合的高亲和性结合剂，例如抗体。当使用抗体时，抗体与特异性荧光标记分子例如肽结合所耗费的时间和成本优化是需要的。另外，在FP测定中，对于磷酸化蛋白和其它反应组分例如脂质和去垢剂而言，具有干扰偏振的潜力。