[发明专利]生产乳酸的细菌及生产乳酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生产乳酸的细菌及生产乳酸的方法。

背景技术

乳酸有L-乳酸和D-乳酸，L-乳酸为工业生产的聚乳酸的原料，另一方面，D-乳酸作为聚合物原料或农药、药物的中间体近年来也备受关注。但事实上在上述任一用途中都要求作为原料的乳酸具有高光学纯度。

自然界中存在有效生产乳酸的微生物，在一些情况下进行使用它们的乳酸制造法，但也产生副产物例如乙酸、乙醇、乙偶姻、丙酮酸等化合物，有时导致作为最终产物的乳酸的品质下降。另外由于光学异构体的混入导致光学纯度下降，也成为严重的问题。

为了避免如上所述的乳酸纯度下降，已经开发了下述方法，即利用近年来发展起来的基因重组技术破坏微生物的特定基因，特异性地阻碍目标副产物的生产。特别是正在尝试利用大肠杆菌、酵母等进行光学纯度高的乳酸生产技术的开发，所述大肠杆菌、酵母等与乳酸菌或丝状菌等本身能高产率生产乳酸的微生物相比，基因组信息丰富，作为基因重组宿主的实际成果充分。

例如，根据Biotechnol Lett.2006 Oct；28(19)：1527-1535(Grabar等的文献)通过下述方法成功生产了光学纯度高的L-乳酸：对作为由大肠杆菌的丙酮酸到D-乳酸的代谢途径的基因的D-乳酸脱氢酶基因(ldhA)、及作为由丙酮醛到D-乳酸的代谢途径的基因的msgA基因进行破坏，在由含有1mM甜菜碱的矿物构成的合成培养基中对来自乳酸片球菌的生产L-乳酸脱氢酶的大肠杆菌进行培养。

该文献显示，不破坏msgA基因的大肠杆菌在甜菜碱存在下，即使破坏D-乳酸脱氢酶基因(ldhA)，由于可生产来自大肠杆菌生物合成的丙酮醛的D-乳酸，所以即使原料中未混入D-乳酸也只能得到96％e.e.左右的光学纯度。

另外，虽然该文献中的大肠杆菌中存在用于分解D-乳酸的FAD依赖性D-乳酸脱氢酶基因(dld)，但只要不破坏msgA基因，则在甜菜碱存在下光学纯度也变为95～96％左右。即，只以大肠杆菌内在的dld基因的表达尚不能充分分解大肠杆菌合成的少量的D-乳酸，更不能得到高光学纯度。另外，使用不存在甜菜碱的培养基，虽然只要原料中不含有D-乳酸就能生产99％以上的高光学纯度的乳酸，但所期望的乳酸的生产速度降低到一半左右。

如上所述，如果不进行msgA基因的破坏和甜菜碱的添加，则难以同时实现L-乳酸的高生产率和高光学纯度。

另外，该文献记载了抑制大肠杆菌生产的D-乳酸的生产，使用不含D-乳酸的培养基来生产高光学纯度的L-乳酸，没有记载培养基成分中含有D-乳酸时提高光学纯度的方法。

日本特开2004-187643号公报中公开了为了得到高光学纯度而使乳酸消旋酶的活性降低的方法。该方法在乳酸产生菌自身制造DL-乳酸时是有效的，但培养基中含有DL-乳酸时没有效果。

另外，Biotech.Bioeng.，Vol.73(1)，pp80-82(2001)中公开了使用L-乳酸脱氢酶将DL-乳酸混合液制成D-乳酸溶液的方法，但报告中的实验是1mL的小规模，乳酸的浓度较低为10mM左右，通常认为在1000mM以上的使用乳酸产生菌的工业生产中是无效的。

另一方面，根据WO2005/033324号说明书，使用破坏了dld基因的大肠杆菌由含有玉米浆的培养基成功生产了高光学纯度的D-乳酸。玉米浆中含有DL-乳酸，破坏了dld基因的大肠杆菌在微好氧条件下抑制D-乳酸的分解，一边分解L-乳酸一边生产D-乳酸，由此成功生产了高光学纯度的D-乳酸。该文献显示，通气对糖的代谢速度、光学异构体的分解速度、杂质的生产速度造成影响，如果过量通气，由于糖的代谢速度下降，所以乳酸的生产速度下降。因此，以生产乳酸为目的时，通气量有上限，需要求出最适的通气量。即，可用于供给作为好氧的代谢反应的L-乳酸的分解的氧气量为至使D-乳酸的生产速度不下降的量。

另外，在工业上希望乳酸的生产速度高，也希望造成光学纯度下降的光学异构体尽量快速分解。将L-乳酸或D-乳酸分解为丙酮酸的酶利用FMN(黄素单核苷酸)或FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸)等辅酶、或者直接利用氧将乳酸转换为丙酮酸。利用辅酶的酶的呼吸即利用氧气对该辅酶的再生是有效的，结果各酶的酶活性受到可供给的氧量的限制。

但是，如果增加氧供给量，可以使光学纯度下降的乳酸快速分解，然而糖的代谢速度也下降，所以所期望的乳酸的生产速度大幅下降。因此，在不受氧量限制的前提下提高来自细胞外的原料的乳酸的分解速度、以更短的时间提高所期望的乳酸的光学纯度是极其困难的。

发明内容