[发明专利]包含具有重氮甲基官能团取代基的吡啶环的标记试剂、用于合成所述试剂的方法以及用于检测生物分子的方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于标记生物分子的新型试剂，用于合成所述标记物方法以及特别是在使用核酸的检测和分析的分子诊断领域中用于标记生物分子的应用。

背景技术

现有技术表明存在许多用于标记核苷酸、寡核苷酸、天然核酸或经扩增的核酸的方法。

一种方法在于将标记物与碱基结合，不管后者是天然的还是经改性的。另一种方法提出将标记物与糖结合，在此仍然不管其是天然的还是经改性的。再一种方法的目的是将标记物与磷酸(phosphate)结合。

在碱基上进行标记已被特别地用于通过插入被直接标记的核苷酸来标记核酸的方法中。

在糖上进行标记常用在通过化学合成制备的核酸探针的情况中。

在磷酸上进行标记也已被用于在寡核苷酸的化学合成过程中引入官能化的臂和标记物。

实际上，需要进行核苷酸或核苷酸类似物或核酸标记的本领域技术人员倾向于在碱基或在糖上进行该结合，这给予他们更多的便利和更多的选择。此外，这也是从许多文献的研究中显现出来的，如关于碱基的EP-A-0.329.198、EP-A-0.302.175、EP-A-0.097.373、EP-A-0.063.879、US-A-5,449,767、US-A-5,328,824、WO-A-93/16094、DE-A-3.910.151、EP-A-0.567.841或关于糖的EP-A-0.286.898。

标记物在磷酸上结合是比将碱基或糖官能化的技术更复杂的技术，并且，由于磷酸的低反应性而特别少地被使用(参见如Jencks W.P.等人，J.Amer.Chem.Soc.，82，1778-1785，1960)。相似地，在涉及将探针引入寡核苷酸片段的方法的O’Donnel和Mc Laughlin的综述(“Reporter groups for the analysis of nucleic acid structure”，p 216-243，于“Bioorganic Chemistry：Nucleic Acids”，Ed.Hecht S.M.，Oxford University Press，1996)中，核苷酸间磷酸二酯的有效烷基化被认为是不可能的。

专利申请WO-A-99/65926描述了用于标记合成或天然的核糖核酸(RNA)的方法，其将RNA断裂并且在末端磷酸上进行标记。该文献描述了可用于标记和断裂的一些官能团，如羟基、胺、肼、烷氧基胺、卤代烷和苄型卤代烷官能团，特别是衍生物5-(溴甲基)荧光素。这些官能团使对核酸进行标记成为可能，但是由于这样的标记发生在断裂过程中释出的磷酸上，所以需要包括断裂步骤以进行有效的标记。此外，需要加入相对于RNA显著过量的标记试剂以得到有效的标记，这在检测过程中产生由过量的标记物造成的背景噪声问题。最终，该方法不能有效地用于双链DNA。

因此，人们需要新型试剂，其在标记结果方面是有效的，在标记位置方面是特异性的，并且特别地，其不影响通过氢键参与双螺旋形成的碱基的杂交性质，所述的新型试剂可用于DNA和RNA，最后，其能对核苷酸、寡核苷酸、天然核酸或通过转录、逆转录或通过酶扩增制备的那些核酸进行非选择性标记。

本申请人已提出了符合上述条件的新型标记物，其使用重氮甲基官能团作为用于标记的反应性官能团。例如专利申请WO-A-02/090319、WO-A-02/090584和WO-A-2005/092910中情况就是这样。

因此，重氮甲基官能团(结构式-C(N₂)-)已被用于磷酸基团的烷基化，但却产生了一些问题。一方面，包含至少一个重氮官能团的试剂通常本身是不稳定的，这在将这些试剂用于标记试剂盒时产生问题，如果经标记的产物的官能团要显示一些样品中存在目标生物分子，这就是不利之处。

最后，为确保稳定性，将由苯基型的芳环产生的具有重氮甲基官能团的试剂与某些标记物如生物素结合。所述芳环的存在和所述标记物的性质使得这些试剂在水中的溶解度差，这导致使用与水混溶的有机溶剂进行与仅溶于水或水性缓冲液的生物分子的偶联。但是如果以过高的浓度将这些溶剂用于标记反应，则它们可能造成所述生物分子沉淀。此外，为了集成设备中标记规程的自动化，必需将所述标记试剂在不含有机溶剂的缓冲液中冷冻干燥。后者不适于冷冻干燥。因此，需要能够获得在水性介质中充分可溶且稳定的标记试剂。

由前述文献WO-A-02/090319、WO-A-02/090584(第一代分子)和WO-A-2005/092910(第二代分子)提出的标记试剂也解决了这些技术问题。

因此，这些分子存在以下的缺陷：