[发明专利]真核细胞的长期培养方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及永生化细胞，及其在实验研究、治疗及检测方面的用途。本发明提供了一种采用蛋白而非核酸的永生化细胞的新方法。

背景技术

制备转化细胞的传统方法是利用E6/E7病毒致癌基因的DNA或RNA。此后，可将所述基因转染入靶细胞。或者，将所述基因克隆进入病毒载体，所述杂交载体通过病毒感染转移到靶细胞内。多数情况下，为了使其后的工作步骤及筛选更加便捷，所述基因转移载体上有一个耐药基因作为标记。一般地，使用耐药基因标记后，细胞能在基因转移后立即被筛选出来。或者，可允许正常细胞死亡，分析存活细胞，确定特性以供后用。

目前迫切需要一种大量制备细胞的方法，此方法不含有或最低程度含有的癌细胞和转化细胞不必要的特性。而且也明确地需要一种细胞系，其能够很容易地繁衍、维持培养、并有能力分化、基因变异、稳定代谢，以及对细胞外的试剂有一致反应。对于诸如细胞治疗和组织工程等临床应用，能够将源自各种器官的细胞无需基因修饰而大量增殖是非常重要的。

发明内容

为了实施本发明，本发明提供了一种永生化蛋白复合体，其包括内化分子、转化多肽，及核内体释放分子；在一个优选实施方案中，所有的分子和/或多肽可以被有效连接到一个或多个其它多肽上。在另一个优选实施方案中，内化作用是核内体介导的。在另一个优选实施方案中，所述永生化蛋白复合体进一步包括核内化分子和端粒延长分子。在进一步实施方案中，内化功能和核内体释放功能由同一分子完成，因此内化分子和核内体释放分子是相同的，例如使用病毒颗粒和病毒衣壳蛋白的情况下。

本发明同样包括编码永生化蛋白复合体的永生化多核苷酸；携带表达载体和永生化蛋白复合体的多核苷酸的杂交载体；通过杂交载体被转化的细胞；表达永生化蛋白复合体的细胞；含有永生化蛋白复合体的组合物；和细胞永生化试剂盒，其包括永生化蛋白复合体，和/或编码蛋白复合体的多核苷酸，和/或携带多核苷酸的杂交表达载体，及如何实施永生化细胞方法的说明书。

另外，本发明的另一方面涉及一种制备永生化细胞或延长原代细胞存活期的方法，其包括将本发明所述的永生化蛋白复合体与靶细胞在一定条件下接触，经过一段有效时间，蛋白复合体被内化，转化多肽被释放；并允许转化多肽延长细胞的存活期，和/或克服细胞增长停滞，和/或克服细胞衰老，和/或阻止细胞分化。在一个优选执行方案中，此方法进一步包括从细胞培养基中移除永生化蛋白复合体，以逆转永生化效果，获得具有正常表型及能够经历完全分化的细胞。

本发明也涉及根据以上方法处理过的细胞和组织。

附图说明

图1表示根据本发明的一个实施方案所进行的E6融合蛋白复合体诱导表达的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。泳道M是低分子量标记；泳道1包含样本未采用IPTG诱导，37℃培养8小时；泳道2包含样本采用0.5mM IPTG诱导，37℃培养4小时。

图2表示根据本发明的同一实施方案所进行的E6融合蛋白复合体的SDSD-PAGE和蛋白免疫印迹。泳道1是考马斯蓝染色的E6融合蛋白复合体；泳道2是用抗E6抗体标记的所述融合蛋白复合体的蛋白免疫印迹；泳道M是低分子量标记。

图3表示根据本发明的另一个实施方案所诱导的E7融合蛋白复合体的SDS-PAGE。泳道M是低分子量标记；泳道1是采用0.5mMIPTG诱导，37℃培养4小时后的上清；泳道2是采用0.5mM IPTG诱导，25℃培养5小时后的上清；泳道3是未采用IPTG诱导，37℃培养4小时后的上清。

图4表示根据本发明的同一个实施方案从Ni-IDA柱洗脱后的E7融合蛋白复合体。泳道1是洗脱部分；泳道M是蛋白标记。

图5表示根据本发明的同一实施方案采用Ni树脂分离E7和标记。泳道M是分子量标记；泳道1是纯化柱洗脱部分；泳道2是采用HPV 16E7特异性抗体标记后的蛋白免疫印迹。

图6表示根据本发明的另一个实施方案，角化细胞对E6和E7融合蛋白中的HPV 16的应答。(a)0.75μg/mL E6融合蛋白+0.25μg/mL E7融合蛋白；(b)1μg/mL E6融合蛋白+0.33μg/mL E7融合蛋白；(c)0.67至2μg/mL E7融合蛋白；(d)＞2μg/mL E7融合蛋白；(e)2至6μg/mL E6融合蛋白；(f)＞6μg/mL E6融合蛋白；(g)对照。

从以下的讨论中可知，本发明的其它目标，优势及特征对于本领域技术人员来说是显而易见的。

具体实施方式