[发明专利]包含具有三个官能性末端的非肽基聚合物的多肽复合物

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白复合物，其允许具有二聚体蛋白的生理活性多肽具有长期作用活性。更具体而言，本发明涉及蛋白复合物及其制备方法，在所述蛋白复合物中，生理活性多肽和二聚体蛋白通过各自的共价键与具有三个官能性末端(3个臂)的非肽基聚合物连接。

背景技术

由于多肽的低稳定性，它们通常易于变性和被蛋白酶降解并失去其活性。另一方面，肽类的大小相对小，因此它们容易通过肾脏被排泄。

为了保持所需的血液水平浓度及其效价，需要频繁给予含有多肽或肽作为活性成分的蛋白药物。然而，由于大多数情况下蛋白药物为适于注射的形式，因此保持生理活性多肽或肽合适的血液水平需要频繁注射，这对患者造成很大的痛苦。为了克服上述问题，已努力尝试通过提高蛋白药物在血液中的稳定性和使血液药物长时间维持高水平来提供最大的药物效果。这些长效蛋白药剂需要不仅能够提高蛋白药物的稳定性并保持药物本身足够的效价，而且不会在患者体内引起免疫应答。

常规地，将诸如聚乙二醇(PEG)的高可溶性聚合物通过化学方法接到蛋白的表面上，目的是稳定所述蛋白、阻止蛋白酶与所述蛋白接触以及抑制小型肽的肾损失。在被接到蛋白上的特异性位点或多个不同位点之后，PEG对于蛋白的稳定和防止蛋白水解是有用的，并且不会产生明显的副作用。此外，被接上的PEG增加了蛋白的分子量，从而抑制蛋白的肾损失并保持蛋白的生理活性。

例如，WO 2006/076471描述了B型利钠肽(BNP)在治疗充血性心力衰竭中的用途。BNP与利钠肽受体A(NPR-A)结合，从而触发cGMP的合成，由此降低动脉血压。据描述，当BNP被PEG化时，其生理活性被延长了很长一段时间。美国专利第6,924,264号也公开了通过将PEG接到艾塞那肽的赖氨酸残基上可以延长其活性期。

为了提高药物多肽的生理活性，将所述药物多肽连接到PEG的两个末端，以形成双缀合物(美国专利第5,738,846号)。另一方面，将两种不同的药物蛋白连接到PEG分别的两个末端上，以形成具有两种不同生理活性的蛋白复合物(WO 92/16221)。然而，在活性保持方面，未发现这些蛋白具有显著改进。

此外据报道，G-CSF和人白蛋白与一个PEG连接成的融合蛋白的稳定性有所提高(Kinstler et al.，Pharmaceutical Research 12(12)：1883-1888，1995)。然而发现，具有G-CSF-PEG-白蛋白结构的经修饰的药物与单独天然药物相比，其滞留时间仅提高了约4倍并且其血清半衰期也仅有轻微的提高。因此，这种经修饰的药物实际上并不能作为长效剂。

当与PEG偶联后，肽类变得稳定，从而延长其在体内的保留时间。但是，当涉及高分子量时，PEG使生理活性肽的效价显著降低并且与肽的反应性下降，造成低产率。

另一种提高生理活性蛋白在体内的稳定性的方法是利用基因重组。将编码在血液内高度稳定的蛋白的基因与编码目的生理活性蛋白的基因相连接，然后转化入动物细胞中，随后将细胞进行培养，以产生融合蛋白。

例如，已有报道，将目前已知在稳定化蛋白中最有效白蛋白或其片段与目的生理活性蛋白融合而形成融合蛋白(WO 93/15199和93/15200，欧洲公布第413,622号)。此外，由Human Genome Sciences从酵母产生的干扰素α和白蛋白的融合蛋白(商品名：Albuferon)能够将其血清半衰期从5小时提高至93小时，但是其关键的缺点是生物活性被减少到低于天然干扰素的5％(Osborn et al.，J.Phar.Exp.Ther.303(2)：540-548，2002)。

对于肽类而言，WO 02/46227和美国专利第6,756,480号中提到了肽类的修饰，WO 02/46227公开了使用基因重组技术将GLP-1、艾塞那肽及其类似物与人血清白蛋白或免疫球蛋白片段(Fc)融合；美国专利第6,756,480号公开了甲状旁腺激素(PTH)或其类似物与免疫球蛋白片段(Fc)的融合蛋白。上述方法可以克服聚PEG化的低产率和非特异性，但是其缺点在于血清半衰期并未显著增加，而且在某些情况下会导致低效价。各种肽连接物被用于最大化地增加血清半衰期，但是表明有很大可能会引起免疫应答。当使用诸如BNP的具有二硫键的肽时，很可能会诱导错误折叠并因此难以应用。