[发明专利]高容量固相

说明书

本发明涉及用于生物亲和性测定和其它固相应用的高容量固相。本发明还涉及该高容量固相的用途及其制备方法。

固相生物亲和性测定根据将抗体或其它生物分子吸附在固体载体上，例如在球形颗粒的外表面，或在试管、微量滴定孔的内表面或平面“芯片”表面，其然后用于固定第二个捕捉分子或待测的分析物。

现在，已知许多不同的包被技术用于制备固相应用的功能性活性表面。然而，当前对测定灵敏度、动力学和耐用(robustness)的期望提出了对于关键测定成分的新要求，例如固相性质。现有的模型表面常常不能满足对于测定性能和更高表面结合容量的要求。

产生固相包被的最简单方法是在固体载体上吸附未修饰的蛋白质，所述固体载体常常由聚苯乙烯、聚丙烯或一些其它塑料材料或玻璃制成。将蛋白质溶解于缓冲液，例如碳酸盐或磷酸盐缓冲液，然后施加在固体载体的表面。所述包被在湿润的环境下进行，然后利用饱和步骤阻断非特异性结合位点，最后干燥表面。然而，由于常常仅有小部分天然蛋白质在该被动吸附后保留其活性，因此在结合容量方面，以此方法获得的固相包被常常不是最佳选择。

因此，多项研究寻求改善蛋白质包被的吸附性质和表面稳定性，例如蛋白质在吸附在固体载体前偶合至不同的″载体″蛋白质。常常需要修饰大分子的天然结构以产生改善的吸附性质，满足测得的需求。

一种此类大分子为链亲和素，其广泛用于捕捉生物素化的蛋白质至固相上。已经在许多基于固相的应用包括微阵列、生物传感器和其它生物亲和性测定中应用链亲和素紧密结合生物素的基本性质。

US 5,061,640A描述了较大前体蛋白质增强链亲和素的吸附性的用途。所述方法提供了包被方法，其通过将链亲和素连接至更疏水的载体分子如牛血清白蛋白上，然后包被在疏水固体载体上改善链亲和素在固体载体上的附着，因此得到具有改善结合性质的固相。

改善被包被物质的吸附性质的另一方法描述在US 6,638,728B1中，其描述了单体链亲和素与双功能交联剂的聚合，以提供链亲和素的二聚体、三聚体和四聚体的混合物，当吸附在聚苯乙烯上时，其比天然的链亲和素表面具有改善的生物素结合容量。

巯基化的(thiolated)链亲和素经二硫基(disulphide groups)的聚合也已经显示提供了固相性质的改善，当被包被在聚苯乙烯表面时，通过在孵育期间最小化蛋白质从固相漏出而产生增强的表面稳定性(L.，Laurikainen，K.，2006：“Comparison-study of streptavidin coated microtitration plates”，J.Immunol.Methods.308，203)。然而，该研究还揭示，尽管基于巯基化的链亲和素的包被显示了优于天然的链亲和素的固相性质和改善的结合容量，然而其它包被显示更高的吸附容量。另一方面，所述包被趋于不稳定。

实际上，固相性质高度依赖于所用的包被条件，所述条件包括应用的缓冲液组合物和所使用的包被技术。因此，多项研究已经揭示印刷溶液中缓冲液添加剂改善点形态(spot morphology)和再现性的重要性。为了降低点形态之间的差异和改善点产物(spot production)的总体再现性，常常使用不同的表面活性剂。

因此，对于US 2006/0223074A1，已经提出了用于包被固体载体的点样溶液(spotting solution)，其包括亚烷基二醇、甜菜碱、洗涤剂和盐。甜菜碱具有两性离子结构，而在US 2006/0223074中公开的洗涤剂为离子型或非离子型。该组合物提供了高度的点一致性(spot consistency)和稳定性，以及便于生产和长期保存。

其它研究报道了多项关于DNA-微阵列的优化的缓冲液组合物。然而，尽管这些研究报道了当使用甜菜碱作为点样溶液的添加剂时，比不含添加剂的常规点样溶液信号强度有所改善，但是此类包被得到较小的总结合容量。

因此尚存在为固体载体提供固相包被的要求，其中所述固相展示高结合容量却不降低稳定性性质。

因此本发明的一个目的是提供此类高容量固相，其可用作高效应用如微阵列、生物传感器和其它生物亲和性测定。

因此本发明的第一个方面涉及高容量固相，其利用包括以下依次步骤的方法制备：

a)在两性离子添加剂的存在下，用分析物-特异性生物分子包被固体载体，其中所述的生物分子包含SH-基团，

b)孵育固体载体充足时间，以将所述生物分子固定至所述固体载体，以及

c)干燥所述固体载体。