[发明专利]利用甘露糖基转移酶抑制剂有效生产异源蛋白质

说明书

背景技术

糖蛋白在人和其它哺乳动物中调节许多必需功能，包括催化作用、信号转导、细胞间通讯以及分子识别和缔合。在真核生物中，糖蛋白构成了非胞质蛋白质的的主要部分(Lis和Sharon，1993，Eur.J.Biochem.218：1-27)。已开发了许多糖蛋白用于治疗目的。在最近二十年间，天然发生的糖蛋白的重组形式已成为生物技术工业的主要部分。用作治疗剂的重组糖基化蛋白质的实例包含红细胞生成素(EPO)、治疗性单克隆抗体(mAbs)、组织纤维酶原激活物(tPA)、干扰素-β(IFN-β)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和人绒毛膜促性腺素(hCH)(Cumming等人，1991，Glycobiology 1：115-130)。随着作为潜在的预防剂和治疗剂而产生的重组蛋白质接近临床应用，重组产生的糖蛋白的糖基化模式的变化近来已成为备受科学界关注的主题。

一般地，糖蛋白寡糖的糖基化结构根据用来产生它们的细胞的宿主物种而变化。非人宿主细胞产生的治疗性蛋白质很可能含有非人糖基化，可能引起人的免疫原性反应，例如酵母中的超甘露糖基化(Ballou，1990，Methods Enzymol.185：440-470)、植物中的α(1，3)海藻糖和β(1，2)-木糖(Cabanes-Macheteau等人，1999.Glycobiology，9：365-372)、中国仓鼠卵巢细胞中的N-乙酰神经氨酸(Noguchi等人，1995.J.Biochem.117：5-62)和小鼠中的Galα-1，3Gal糖基化(Borrebaeck等人，1993，Immun.Today，14：477-479)。在动物细胞中与蛋白质结合的糖链(carbonydrate chains)包含与该蛋白质天冬酰胺(Asn)残基结合的N-糖苷键型糖链(也称为N-聚糖；或N-联糖基化)和与该蛋白质丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)残基结合的O-糖苷键型糖链(也称为O-聚糖；或O-联糖基化)。

因为非人哺乳动物细胞产生的糖蛋白的寡糖结构倾向于更接近人糖蛋白的寡糖结构，所以大多数商用糖蛋白是哺乳动物细胞产生的。但是，哺乳动物细胞作为产生蛋白质的宿主细胞具有几个重要的缺点。除了费用高之外，哺乳动物细胞产生蛋白质的过程产生糖形异质群、具有低的体积滴度、并需要进行性的病毒抑制和相当长的时间来产生稳定的细胞系。

充分认识到的是蛋白质上的具体糖形可能深刻地影响蛋白质的性质，包括它的药物代谢动力学、药物动力学、受体相互作用和组织特异性靶向性质(Graddis等人，2002.Curr Pharm Biotechnol.3：285-297)。例如，已经显示了Ig的不同糖基化模式与不同生物学性质相关(Jefferis和Lund，1997，Antibody Eng.Chem.Immunol，65：111-128；Wright和Morrison，1997，Trends Biotechnol.，15：26-32)。进一步已经显示了糖蛋白的半乳糖基化可随细胞培养条件而变化，可使一些糖蛋白组合物产生免疫原性，这取决于糖蛋白上的具体半乳糖模式(Patel等人，1992.Biochem J.285：839-845)。但是，因为还不知道哪种具体糖形(或多种糖形)产生所希望的生物学功能，所以非常需要在糖蛋白上富集具体糖形的能力。因为不同糖形与不同生物学性质相关，富集具有具体糖形的糖蛋白的能力可用于阐明糖蛋白的具体糖形与该糖蛋白具体生物学功能之间的关系。另外，富集具有具体糖形的糖蛋白的能力能够产生具有具体特异性的治疗性糖蛋白。因此，非常需要产生具体糖形富集的糖蛋白组合物。

虽然N-联糖基化的途径已成为许多分析的对象，但是O-联糖基化的过程和功能还没有很好地理解。但是，已知的是，与N-联糖基化不同，O-糖基化是发生在顺面高尔基体中的翻译后事件(Varki，1993，Glycobiol.，3：97-130)。尽管看上去对于O-联糖基化不存在类似N-联糖基化的共有受体序列，但是几种糖蛋白大量O-联糖基化位点周围的氨基酸序列比对显示：在相对于糖基化残基的-1和+3位脯氨酸残基的频率增加，以及丝氨酸、苏氨酸和丙氨酸残基的明显增加(Wilson等人，1991，Biochem.J.，275：529-534)。在糖蛋白中丝氨酸和苏氨酸残基的延伸也可能是O-糖基化的潜在位点。