[发明专利]累积的时间分辨发射双向凝胶电泳

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于蛋白质的胶内检测和定量的方法和新的图像获取技术。这种新平台称为累积的时间分辨发射双向凝胶电泳(CuTEDGE)，利用荧光寿命的差异来区分来自特异性蛋白质标记的荧光和非特异性背景荧光，致使与现有技术相比在灵敏度和动态范围方面均有明显的提高。

背景技术

“蛋白质组学”是指对基因组的全部蛋白质(蛋白质组)进行的研究，是由Marc Wilkins于1994年提出的术语。在过去十年里，已经开发了多种对细胞或组织内的成千上万种蛋白质同时定量的方法并且用于例如细胞过程的生物标志物发现或机理研究。双向凝胶电泳(2-DGE)是适合于完全蛋白质组学分析的第一种方法，并且还构成了蛋白质组学研究中的主力之一。2-DGE法包括在第一向根据蛋白质的电荷和在第二向根据蛋白质的分子大小来分离复杂的蛋白质样品，产生一种二维蛋白质斑点图，其中理想的是每个斑点相当于单独的蛋白质组分。然后，采用按化学计量与蛋白质结合的蛋白质染色剂来可视化蛋白质斑点，从而得到相当于蛋白质丰度的第三维度，便于定量的蛋白质组分析。

与最初的2-DGE技术有关的胶与胶之间的大变化问题已经通过掺入内标，例如差异凝胶电泳(DIGE)技术和Alexa标记的内标(ALIS)技术，得到了解决。两种构思均基于采用光谱学上分离的荧光染料标记的样品蛋白质和内标蛋白质，并在共同分离在2-DGE凝胶上。通过比率测量标准化，可以校正凝胶之间的变化，因此极大地提高了2-DGE技术的定量方面和总体的统计学检验功效。

在当前2-DGE方法中存在的主要制约是检测的灵敏度方面的限制。生物样品中的蛋白质丰度可能高达12个数量级这一事实，对在定量2-DGE中使用的蛋白质染色的灵敏度和动态范围均有很高的要求。以此为目标，动态范围为3-4个数量级的荧光染色已经取代了使用传统的比色染色法，例如动态范围通常局限于1-2个数量级的银染和考马斯亮蓝染色(图1)。

荧光染料可用于在2-DGE分离之前的共价标记(例如CyDyes^TM，Alexa-dyes)，以及电泳后染色过程的非共价标记(例如SYPRORuby^TM，Deep Purple^TM)。然而，当前在市场上甚至进行蛋白质可视化的最好的荧光探针仅涵盖非常小部分的潜在的生理学范围，因为生理学的蛋白质丰度范围在几摩尔到微摩尔浓度，而对于最低DIGE的现有技术方法的检测限度通常限于纳克的蛋白质(图1)。

在当前使用的2-DGE中蛋白质检测和定量的荧光中，荧光染料的激发和产生的发射的测定同时发生。由于在时间上有效和技术角度上的实用，该方法被用于荧光扫描仪和基于CCD照相机的2-DGE图像获取仪器。但是，直接的荧光测量并不利用这些荧光染料的全部潜能。生物样本包含许多自发荧光组分，并且聚丙烯酰胺基质自身在一定程度上发射背景荧光。因此，为了优化信噪比，降低背景荧光和自发荧光的干扰非常必要。

在当前的2-DGE技术中，试图通过电泳后的计算机辅助定量分析中使用的软件算法在数学上去除产生的背景。然而，我们之前已经表明，大部分背景减除和校正算法改变了数据并将附加的变化引入到蛋白质斑点体积的定量中，并形成了倾斜的、非正态分布(1-4)。

通过时间分辨荧光(TRF)，光子源可以来源于通过分离存在于给定像素中的各种荧光组分的衰减曲线。目前，TRE在相关领域中有许多应用，主要是显微镜应用于可视化定位、折叠动力学或溶液中蛋白质的运动(5，6)。目前，在2-DGE中使用的一些荧光染料已被用于这些相关领域中的时间分辨荧光应用中(例如，得自GE Healthcare，Uppsala，Sweden的CyDyes^TM，和Alexa-dyes以及钌螯合物例如SYPRO Ruby^TM，二者均得自Molecular Probes，Eugene，OR，USA(7，8))。然而，目前该特征在现代2-DGE图像获取设备中的缺乏阻止了2-DGE中TRF的使用和开发。

相关技术描述