[发明专利]病毒定量方法

说明书

技术领域

本发明涉及对从体液采集的人疱疹病毒(HHV)数进行定量的方法、以及用于进行该方法的试剂盒。

背景技术

“疲劳”的蓄积会引起过劳死、自杀、生活习惯病等许多严重问题。但是，针对”疲劳”的科学或医学研究与其它领域相比明显迟滞，对于“疲劳”带给个人健康、社会生活的问题尚未找到解决的突破口。

作为针对“疲劳”的研究或预防方法/治疗方法的开发迟滞的主要原因，可以列举出：没有客观地测定“疲劳”的方法。特别是，关于对生活、健康影响最大的“疲劳的蓄积”、“中长期持续疲劳”，其测定方法尚未确立，而对于这样的测定方法的需求非常迫切。

本申请的发明人之一曾经开发出通过测定唾液中再活化的人疱疹病毒的量来测定疲劳的蓄积的方法(WO2006/006634)。根据目前为止的研究可以判定：通过利用该方法，能够定量地测定因1周以上时间的各种紧张状态而蓄积的疲劳。而且，在该方法中，优选使用唾液作为试样，而关于唾液，已知唾液腺中的内源生物素含量高(Green，M.，et al.，J.Clin.Pathol.，(1992)45(9)：788-790)。

传统上，作为对病毒进行定量的方法，已知有通过PCR对病毒DNA量进行定量的方法(Kido，S.，et al.，J.Med.Virol.，(1990)32：139-142)、通过双嵌套PCR法(Double-Nested PCR)进行测定的方法(Kondo，K.，et al.，J.Infect.Dis.，(1993)167：1197-1200)等。此外，在逆转录病毒的定量方面，还公开了在通过定量PCR测定病毒DNA量时，使用包含含标记序列的病毒核酸的逆转录病毒作为内部标准的方法(WO95/034684)。

此外，作为测定病毒蛋白质的量的方法，有例如使用抗病毒蛋白质的抗体的免疫测定方法(immunoassay法)。作为代表性的免疫测定方法，可以列举出例如夹心ELISA法等(Gerna，G.，et al.，J.Clin.Microbiol.，(1983)17：942-944)。

另一方面，作为提高溶液中病毒的浓度、浓缩病毒的方法，可以列举出例如超离心法，但是，该方法需要昂贵的仪器和漫长的分离时间，且作业中需要大量的劳力。此外，还有用硫酸铵、聚乙二醇等沉淀病毒来进行浓缩的方法，但由于这些方法中使用的试剂会阻碍其后的用于病毒检测的PCR，因而存在的问题是病毒沉淀后必须进行试样的纯化。作为其它的病毒浓缩方法，公开了例如使用结合有甘露糖结合型凝集素的磁性粒子的方法(特开2002-165591)。此外，作为提高逆转录病毒的效价或者从待检物样品中分离逆转录病毒的方法，还公开了利用链霉抗生物素蛋白和生物素化凝集素的方法(WO2001/079456)。

现有技术文献

专利文献1国际公开第WO2006/006634号小册子

专利文献2国际公开第WO95/034684号小册子

专利文献3特开2002-165591号公报

专利文献4国际公开第WO2001/079456号小册子

非专利文献1Green，M.，et al.，J.Clin.Pathol.，(1992)45(9)：788-790

非专利文献2Kido，S.，et al.，J.Med.Virol.，(1990)32：139-142

非专利文献3Kondo，K.，et al.，J.Infect.Dis.，(1993)167：1197-1200

非专利文献4Gerna，G.，et al.，J.Clin.Microbiol.，(1983)17：942-944

发明内容

发明所要解决的问题

发明人等判明：在定量评价针对日常生活中的疲劳的疲劳度时，如果采用传统方法来测定体液中的人疱疹病毒(以下记作HHV)的量，则视情况而异，试样中的HHV数会非常少，例如人疱疹病毒6(HHV-6)会小于100拷贝/ml、人疱疹病毒7(HHV-7)也会小于100拷贝/ml，在相当多的情况下，测定途中会损失病毒DNA，因而准确且有效率的定量需要技术熟练。而且，在这种情况下，将HHV定量方法试剂盒化从而简便地对大量试样进行定量是困难的。本发明的目的是解决传统病毒定量方法中的上述问题。

解决问题的方法

本发明人等进行了深入研究，结果发现：通过将结合有可与HHV结合的物质的载体混合在体液中并使之与对象病毒结合，并且利用磁铁、离心处理等回收该载体，可以将其制备成能够采用PCR、LAMP、ELISA等方法容易地进行定量的浓度。