[发明专利]制备噬菌体混合物的方法以及该噬菌体混合物在抗生素抗性葡萄球菌治疗中的用途

说明书

细菌感染引发多种疾病，其中一些疾病是致命的。很多细菌感染已成功地通过开发抗生素得以抗击。然而，大量使用不同抗生素已经导致出现经常不仅对一种抗生素有抗性而是对多种抗生素有抗性的细菌。如此高抗性的细菌菌株越来越多地引发严重的问题，特别是发生在医院中，因为在医院中即使在医师实施治疗时病人也可能被这样的菌株感染。如果该菌株对于大多数的通常所用的抗生素具有抗性，这将引起特别严重的疾病，其后果经常是死亡。

在本发明的范围内，请求保护一种抗击细菌的可选手段。存在多种攻击植物和动物且经常引发严重的疾病的病毒，同样地，也存在特异地攻击细菌的病毒。这些病毒被称为噬菌体。它们通常对于特定类型的细菌是特异的且经常连接至细菌细胞壁上那些通常发生养分(例如糖等)吸收的区域。噬菌体的吸收发生在细菌细胞壁上，噬菌体将它们的核苷酸注入到细菌中。核苷酸在细菌中进行复制并形成噬菌体特异蛋白质。当细菌细胞中有足够的噬菌体核苷酸的拷贝数和充足的噬菌体蛋白质时，它们溶解细菌细胞且释放大量已形成的噬菌体进入环境中。然后又可以开始感染的循环。

发现噬菌体用于治疗特定疾病的用途已有几十年。该抗击细菌的方法在东欧国家中得以显著发展。在WO 2004/052274中记载了生产噬菌体组合物的方法，该噬菌体组合物可以用于细菌感染的治疗中且特别地用于治疗由绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)引发的细菌感染。在该申请中，用半固体培养基来培养噬菌体。WO 97/39111记载了生产具有宽宿主谱(a widespectrum of hosts)的噬菌体的方法以及该噬菌体在治疗中的用途。在WO01/50866中公开了用于消灭在各种固体表面上的细菌的噬菌体混合物(cocktail of bacteriophage)，例如在手术室中或甚至在牲畜棚(facilities forhousing livestock)和屠宰场中。

US 2004/0247569记载了含有噬菌体的医药组合物，该噬菌体可以使多种抗生素抗性细菌失活，例如肠球菌、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、假单胞菌等。WO 2006/047870记载了吸附在基质(matrix)上的固定的噬菌体组合物。O’Flaherty等人，在Applied and Environmental Microbiology[2005]，pp.1836-1842中描述了抗葡萄球菌属噬菌体K和其用于控制来自医院的抗生素抗性葡萄球菌的用途。WO 2007/148919记载了金黄色葡萄球菌特异的噬菌体以及其在抗击感染中的用途。Capparelli等人，在Antimicrobialagents and Chemotherapy[2007]，pp.2675-2773中记载了噬菌体M^Sa和其在小鼠模型中对抗金黄色葡萄球菌的用途。Rashel等人，在JID[2007]，pp.1237-1247中记载了对内溶素的克隆，该内溶素是来自噬菌体ΦMR11的分解肽聚糖(peptidoglycan)的酶。

本发明涉及生产噬菌体混合物(mixture of bacteriophage)的方法，其中，首先使葡萄球菌属菌株与可以溶解葡萄球菌的噬菌体在预培养(preculture)中生长，然后进一步在主培养(main culture)中繁殖(reproduction)。然后组合大量所述噬菌体以形成混合物。

所用的噬菌体混合物包括至少两种，优选至少三种不同的噬菌体的血清型(serotype of bacteriophage)，该噬菌体特异地溶解葡萄球属菌种的细菌。噬菌体株优选使用来自肌病毒科(Myoviridae)和短尾病毒科(Podoviridae)的噬菌体。

本发明的一个重要方面是如下事实：使用大量不同的噬菌体，该噬菌体都具有可以溶解葡萄球菌的共同属性。具体来说，所用的噬菌体必须溶解涉及疾病和对于人类和/或动物是致病条件的葡萄球菌。作为特别优选，本发明所用的噬菌体溶解葡萄球菌，且具体来说是金黄色葡萄球菌菌株，其对于抗生素是有抗性的且具体来说是对甲氧西林(methicillin)具有抗性的。本发明的一个重要方面是大量不同的噬菌体存在于噬菌体混合物中。这些噬菌体可以是特异溶解金黄色葡萄球菌菌株的噬菌体，但是它们也可以是溶解其他类型细菌的噬菌体，虽然这种噬菌体株仅优选用于补充属于至少两种不同血清型的噬菌体的混合物。

用于本发明所述方法的噬菌体可以是有特征明确的噬菌体或者是来源于野生分离株。为此目的，使用一般的噬菌体分离方法并且从合适的来源开始，首先通过和葡萄球菌属菌株联合生长使噬菌体增多然后将其用于本发明的方法中。