[发明专利]新型抗原结合二聚体-复合物及其制备方法和应用

说明书

在广泛方面，本发明一般涉及新型二聚体-复合物(本文中称为“非融合二聚体”或NFD)，其包括单可变结构域诸如例如纳米抗体(Nanobodies)，涉及制备这些复合物的方法及其应用。这些非共价结合的二聚体-复合物由两个相同的单体组成，所述单体分别包括一个或多个单可变结构域(同型二聚体)或包括两个分别包括一个或多个单可变结构域的不同单体(异二聚体)。本主题的NFD已被典型地改变，例如与其单体负体相比提高或降低的结合特性。本发明的NFD可以进一步通过由柔性肽或半胱氨酸进行连接来改造，从而改善稳定性。本发明还描述形成所述NFD的条件和可以避免所述二聚体形成的条件。例如，本发明还提供通过向制剂中添加一种或多种增高单可变结构域熔化温度的赋形剂，诸如向液体制剂中加入甘露醇或其他多元醇来抑制NFD，诸如(人血清)清蛋白结合纳米抗体二聚作用的方法。

发明背景

常规抗体的抗原结合位点主要由来自重链和轻链可变结构域二者的超变环形成。然而，功能性抗原结合位点也可以由重链可变结构域(VH)单独形成。在体内，这样的结合位点已经在骆驼(camels)和骆驼(camelids)中进化为抗体的一部分，其仅由2个重链组成且缺少轻链。此外，分析这些骆驼的仅有重链的抗体的VH(也称为VHH)和来自常规人抗体的VH结构域之间氨基酸序列的差别有助于设计改变的人VH结构域(LutzRiechmann和Serge Muyldermans，J.of Immunological Methods(免疫学方法杂志)，卷231，1-2期，1999，25-38)。类似地，已经显示出，通过界面残基的突变研究以及与抗hCG VHH H14平行的抗Her2抗体4D5的VH上的CDR3的突变研究，发现一些突变促进自主VH结构域行为(即，有益的溶解性和可逆的再折叠)(Barthelemy PA等，2008，J.of Biol.Chemistry(生物化学杂志)，卷283，第6号，第3639-3654页)。还发现通过将暴露的疏水性残基替换为更加亲水的残基来增加原先轻链界面的亲水性改善自主VH结构域行为。这些改造的VH显示出主要是处于高浓度的单体的，然而也发现低量的所述改造VH的二聚体和其他聚集体，推测它们形成与关于VL-VH对相互作用的领域中所述的那些类似的相对弱相互作用。类似地，认为骆驼化VH，称为cVH-E2，在溶液中以浓度依赖性方式，即以高于7mg/ml的浓度形成二聚体(但注意，研究中未显示数据；Dottorini等，Biochemistry(生物化学)，2004，43，622-628)。在该浓度以下，二聚体可能分解为单体且这些二聚体是否具有活性(即结合抗原)尚不清楚。此外，近期报道了具有非常短的CDR3(仅6个残基)的截短的美洲驼源VHH(切割掉前7个氨基酸)，称为VHH-R9，形成处于晶体结构的结构域交换二聚体。由于VHH-R9显示出在溶液中具有功能性(针对半抗原的低Kd)并显示出仅由单体组成，所以二聚作用可能在非常缓慢的结晶过程中发生(4-5周)且一些因素诸如N端切割、高浓度条件和短CDR3可以导致或促进“聚合”现象(也具体参见Spinelli等，FEBS Letter(FEBS书信)564，2004，35-40的结论部分)。Sepulveda等(J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)(2003)333，355-365)已经发现VH二聚体(VHD)的自发形成在许多情况下允许生成具有抗原结合特异性的分子。然而，基于关于非融合二聚体报道的自发形成(对比通过本文中报告的PIA形成的二聚体)和稳定性数据的缺乏，这些可能是与由Barthelemy(见前文)所述的那些类似的弱相互作用二聚体。总之，一些文献描述了单可变结构域二聚体及其片段的形成，其a)主要影响相对弱的疏水性相互作用(其是例如根据浓度而可逆的)，和/或b)仅在结晶过程中的另一种情形中发生(例如，作为晶体堆积力的结果)。而且，已经描述这些二聚体不再结合抗原(如在Spinelli(见前文)中)或尚不清楚这些二聚体是否是结合二聚体(如在Dottorini(见前文)和Barthelemy(见前文)中)。

发明内容