[发明专利]复制条码筛选检测

说明书

技术领域

复制条码筛选RBS实验的设计目的是从某种未受实验处理的细胞中，分离出那些对该实验处理可能有应答倾向的细胞。

背景技术

在细胞生物学研究中，一种常规做法是对大量细胞进行实验处理，以筛选表现出某种特定反应的小部分细胞。不同研究之间的筛选机理区别可以很大。有时，筛选的机理是部分细胞在处理后能够存活。一个例子是作为化学抗性和肿瘤复发研究的一种方法，使用化疗药物处理培养的癌细胞以筛选抗性细胞。另一个例子是将肿瘤细胞移植到活体宿主，以由少数存活的移植细胞增殖获得次代肿瘤。有些研究中，筛选方案不是基于存活力，而是基于该细胞亚型是否能获得不同的表型。例如，最近的研究表明，将数个特定基因引入体细胞后可使部分细胞重编程成为与胚胎干细胞ESC极其相似的诱导型多能干细胞iPSC。另一个例子是，在系谱分化的研究中，通常会对干细胞进行某种条件处理，以诱导其中的部分细胞分化为特定谱系。

实际上，在所有情况下，弄清楚为什么只有一部分细胞对实验处理表现出期望的应答是非常有意义的。尤其是在要区分两种可能时非常重要。一种可能是所有细胞具有表现应答的相同内在潜能，但是由于随机原因，如处理时细胞处于不同的细胞周期或者药物暴露不均一，所以最后只有很少一部分细胞表现出应答。另一可能是，一开始，因为遗传或后天差异，处理的细胞在表现出应答的内在潜能是异质的，导致只有一部分细胞表现出应答。在后一种情况下，研究何种遗传/后天差异区分应答细胞和非应答细胞具有重要意义。

以成纤维细胞通过特定基因被重新编程为多能干细胞为例。事实上转染了基因的成纤维细胞只有极小部分可以重编程为多能干细胞，这可能完全由实验的随机性决定。如在基因转染时，细胞处于的细胞周期阶段、转入基因的拷贝数、转入基因的整合位点等。或者，可能是，至少部分是由于某些成纤维细胞本身比其它细胞更倾向于经历重编程。如果后者成立，了解这种易感倾向性的分子基础对进一步了解细胞重编程过程极其重要，并可能改进重编程的操作方案。

同样以通过移植肿瘤细胞获得次代肿瘤细胞为例。事实上，仅有极少数移植的细胞可以形成次代肿瘤细胞，这可能是由于实验过程的随机性造成，或者是原始细胞中的某些细胞具有更大的肿瘤发生遗传潜力（例如肿瘤干细胞假说）。如果后者正确，了解具有更强肿瘤发生遗传潜力的一部分细胞是如何与其余细胞相区分的具有重要作用。

为了区别随机性和趋向性，并深入了解任何可能存在的趋向性的机理，分离经实验处理后表现出所需应答的那部分细胞是非常有用的。然而，人们希望在细胞分离处理前将这些细胞分离出来，因为处理有可能会显著改变细胞的原始特性。

这样便存在一个两难困境：实验处理会对细胞存在未知的影响，因此这样做不理想，但是不经过实验处理又如何知道哪些细胞可能表现出应答？这有点像“种花生农夫的困境”——在中国有一个种花生的农民希望从收获到的花生中选取最美味的留到下一年进行播种，但正是品尝花生这一行为导致花生不适于作为种子了。RBS方案的设计旨在避免这一两难困境。

发明内容

RBS方案的设计目的是分离出那些对实验处理可能会有应答倾向的细胞，但实际上分离的细胞并未接受实验处理。它基于这样一个重要假设：如果一个细胞在实验处理下具有某种应答的趋势是由其固有的遗传或表观遗传特性所决定，那么，当该细胞分裂时，这种趋势有可能被其子细胞所遗传。尽管这未必在所有情况下都正确，但就我们已知的遗传和表观遗传对细胞表型影响的知识来看，这在很多情形行下仍是一个合理的假设。

RBS方案的大体步骤如图1所述。第一步，对细胞进行修饰，使得每个细胞具有一个唯一的基因标识，或称“条码”。第二步，培养这些细胞，以获得许多跟它们一样拥有唯一条码的姐妹细胞。第三步，将细胞分成两部分，一个作为实验组，一个作为预留组。第四步，对实验组细胞进行实验处理以识别阳性细胞——那些在实验处理下表现出某种预期应答的细胞。第五步，读取那些阳性细胞的条码。第六步，也是最后一步，在预留组内，用一种不会显著改变细胞特性的方法回收那些具有相同条码的细胞。这些细胞应该与处理组中的阳性细胞是姐妹细胞。即它们由同一个细胞增殖而来。