[发明专利]吡啶二羧酸/盐的生产方法

说明书

本发明涉及通过培养重组微生物发酵生产吡啶二羧酸/盐(dipicolinate)的新方法，所述微生物表达具有吡啶二羧酸合成酶(dipicolinate synthetase)活性的酶。本发明还涉及相应的重组宿主和适于制备这样的宿主的重组载体、表达盒和核酸，以及使用发酵生产获得的吡啶二羧酸/盐(dipicolinate)制备聚酯或聚酰胺共聚物的方法。

发明背景

吡啶二羧酸(CAS编号499-83-2)也称为吡啶-2，6-二羧酸或DPA，它在不同的技术领域得以应用，例如作为聚酯或聚酰胺类型共聚物合成的单体，吡啶合成前体，过氧化物和过酸的稳定剂，所述过氧化物和过酸例如叔丁基过氧化物、二甲基环己酮过氧化物、过氧乙酸和过氧单硫酸(peroxy-monosulphuric acid)，金属表面抛光液成分，由于存在痕量金属离子而易于变质的有机材料的稳定剂(螯合效应)，环氧树脂稳定剂和摄影用溶液或乳液的稳定剂(阻止钙盐沉淀)。

公知DPA在细菌内生孢子中生物合成。催化从脱氢吡啶二羧酸/盐(dehydrodipicolinate)到DPA的生物合成的酶是吡啶二羧酸合成酶。已经从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)分离了所述酶并进一步了表征了所述酶。它由spoVF操纵子(BG10781，BG10782)编码。

尚未描述所述具有商业兴趣的化合物的发酵生产。

因此，本发明的目的是提供发酵生产吡啶二羧酸或其相应的盐的合适方法。

附图说明

图1描述了pClik5aMCS克隆载体的质粒图谱。

图2描述了枯草芽孢杆菌来源的spoVF基因的DNA序列，用下划线标出了α亚基，用双下划线标出了β亚基。

图3描述了合成的spoVF基因的DNA序列，用斜体字标出了N末端sod启动子，用下划线标出了α亚基，用双下划线标出了β亚基，用粗体字标出了groEL终止子。

发明概述

教导了通过培养表达吡啶二羧酸合成酶的重组微生物发酵生产吡啶二羧酸/盐(吡啶二羧酸或其盐)的本发明解决了上述问题，所述酶转化了在所述微生物中以赖氨酸生物合成途径过程中的中间产物形式形成的二氢吡啶二羧酸/盐。

发明详述

1、优选的实施方案

本发明涉及发酵生产DPA的方法，该方法包含培养至少一种重组微生物，该微生物优选源自具有利用二氨基庚二酸(DAP)途径以二氢吡啶二羧酸/盐，特别是L-2，3-二氢吡啶二羧酸/盐为中间产物生产赖氨酸的能力的亲本微生物，且该重组微生物在性质上或数量上保留了所述亲本微生物的所述能力，并额外具有表达异源吡啶二羧酸合成酶的能力，因此二氢吡啶二羧酸/盐，特别是L-2，3-二氢吡啶二羧酸/盐被转化成DPA。所述修饰的微生物还可保留或不保留其赖氨酸生产能力。

具体而言，所述亲本微生物是产赖氨酸细菌，优选棒状杆菌。具体而言，所述亲本微生物是棒杆菌属(Corynebacterium)细菌，如谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

所述异源吡啶二羧酸合成酶的起源为原核生物或真核生物。例如，所述异源吡啶二羧酸合成酶可起源于芽孢杆菌属(Bacillus)细菌，特别是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。所述芽孢杆菌属的酶至少由一个α亚基和至少一个β亚基组成。

吡啶二羧酸合成酶α链的蛋白质序列是：

MLTGLKIAVIGGDARQLEIIRKLTEQQADIYLVGFDQLDHGFTGAVKCNIDEIPFQQIDSIILPVSATTGEGVVSTVFSNEEVVLKQDHLDRTPAHCVIFSGISNAYLENIAAQAKRKLVKLFERDDIAIYNSIPTVEGTIMLAIQHTDYTIHGSQVAVLGLGRTGMTIARTFAALGANVKVGARSSAHLARITEMGLVPFHTDELKEHVKDIDICINTIPSMILNQTVLSSMTPKTLILDLASRPGGTDFKYAEKQGIKALLAPGLPGIVAPKTAGQILANVLSKLLAEIQAEEGK(SEQ ID NO：2)

吡啶二羧酸合成酶β链的蛋白质序列是：