[发明专利]检测乙肝病毒复制能力和抗病毒药物敏感性的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及检测乙肝病毒复制能力和抗病毒药物敏感性的方法 。

背景技术

乙型病毒性肝炎(Viral hepatitis B)是目前危害我国人民身体健康最为严重的感染性 疾病。据调查，我国慢性乙肝病毒感染者多达1.2亿以上，其中慢性乙肝患者达2000万以上 。部分携带者及慢性肝炎患者中可发展为重症肝炎、肝硬化甚至肝癌，每年死于肝炎及其相 关性疾病的患者不下30万例。乙肝病毒感染至今尚无特效治疗方法。由于HBV的宿主范围狭 窄，有明显嗜肝性，体外培养困难，极大限制了HBV感染相关的分子机制研究和抗病毒药物的 疗效评价。因此，迫切需要建立一种检测乙肝病毒复制能力和抗病毒药物敏感性的方法。

随着现代分子生物学技术的发展，多种有关HBV复制的细胞模型及动物模型相继建立， 为HBV的研究和抗HBV药物评价提供了十分有用的工具。主要包括天然HBV颗粒感染的成人肝 细胞和胎肝细胞模型、HBV基因组稳定转染的肝癌细胞模型、HBV转基因动物模型、嵌合体小 鼠模型、HBV感染树鼩模型等。但上述模型还存在诸多不足，如HBV存在时间短暂或制备周期 长、费用高昂等问题。

近年来，采用复制型HBV基因组检测乙肝病毒复制能力和抗病毒药物敏感性成为研究的 热点，并显示出广阔的应用前景，其优越性在于：(1)所用HBV病毒基因组结构具有单一性和 可操控性，并能产生全部HBV mRNA转录(3.5Kb、2.4Kb/2.1Kb、0.7Kb)、HBV DNA复制中 间体和包括HBsAg/HBeAg在内的HBV抗原蛋白的表达，较好地模拟HBV在HBV感染者体内的复制 过程，有望用于特定HBV病毒株感染的分子机制研究以及抗病毒药物的疗效评价。(2)研制 周期短，费用低，且可以对HBV基因组进行体外定点诱变，就临床研究中发现的可疑位点进 行潜在耐药性评估。(3)Tang和Priscilla等采用HBV基因组建立的复制HBV型小鼠模型，血 清病毒学、生化学改变与HBV感染人的自然感染过程极为相似；Klein等应用该模型评价核 苷类似物和siRNA对HBV复制的抑制作用。(4)HBV基因组可通过质粒载体导入细胞内，也 可利用重组腺病毒载体制备携带HBV基因组的腺病毒。后者可高效率感染跨种属细胞，如小 鼠、大鼠、树鼩肝细胞、鸭肝细胞等；HBV复制水平和产量可通过调节HBV重组腺病毒的感染 数量进行控制，便于选择合适的HBV复制水平进行药效试验；还可用来研究不同种属和器官 源的细胞支持HBV复制的能力，为研究HBV感染种属和器官特异性提供有力的工具。

国内外有关HBV复制能力的检测方法主要集中在以下方面：

1.HBV基因片段的选择

HBV基因组全长3.2kb，分别调控3.5kb，2.4kb，2.1kb，0.7kb长度的HBV mRNA的转录，并编 码合成HBcAg、HBeAg、DNA多聚酶、HBsAg及HBx蛋白。HBV全基因组、S基因组、X基因组的 HBV转基因小鼠目前均有报道。Chisari等率先建立能表达HBsAg的HBV转基因小鼠模型，肝 细胞呈现“毛玻璃样”改变，最终结节再生；Wirth等用HBV调节成分或小鼠白蛋白启动子控 制的HBV S编码区序列产生了HBs转基因小鼠模型，所有肝细胞均表达HBsAg并分泌至血液循 环。Guidotti等用含小鼠主要尿蛋白启动子控制的C基因编码区及SV40多聚腺苷酸尾的质粒 ，显微注射C57BL/XSJL胚胎后产生Mup-Core50系小鼠，通过与亲代C57BL/6逆代杂交而繁殖 ，MC50鼠在小鼠主要尿蛋白启动子转录控制下表达HBV核心蛋白，出生时肝内存在少量的核 心蛋白，随时间延长逐渐增多。屠亚军等建立了人HBx基因转基因小鼠模型，所用 HBV(adr)1.15kb DNA片段(病毒基因第707～1856位核苷酸)含完整的HBx基因编码区、转 录增强子、主要RNA起始位点及多聚腺苷酸位点，结果小鼠肝、肾、睾丸组织内检出高水平 0.7kb转录物，免疫沉淀法证实HBx蛋白的存在；小鼠4月龄时出现肝细胞癌前病变，8～10 月龄时出现肝内肿瘤结节；针对X基因起始区的反义核酸药物可有效地抑制HBx转基因小鼠肝 脏HBx基因的表达。但上述HBV部分片段转基因小鼠模型仅表达单一基因产物，不能产生病毒 ，因此不适宜研究病毒复制机制及抗病毒药物疗效的评价。