[发明专利]检测乙肝病毒复制能力和抗病毒药物敏感性的方法

权利要求书

1.扩增制备1.3拷贝的HBV基因组的引物组，包括以下两对引物：

扩增制备HBV2.4片段的引物对：

上游引物序列PF 1：5’-CCTGCTTTAATGCCTTTGTATGC-3’；

下游引物序列PR1：5’-TCCACCACGAGTCTAGACTCTGTGG-3’；

扩增HBV1.7片段的引物对：

上游引物序列PF2；5’-CCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGA-3’；

下游引物序列PR2：5’-CGGTGTCGAGGAGATCTCGAATAGA-3’。

2.检测乙型肝炎病毒复制能力或抗病毒药物敏感性的试剂盒，其特征在于：含有权利要求1 所述的引物组。

3.扩增1.3拷贝HBV基因组的方法，其特征在于包括以下步骤：用权利要求1所述的引物组 从含HBV的样品中扩增制备1.3拷贝HBV基因组并连接到目的载体上；所述目的载体为不含 有外源启动子的载体。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的1.3拷贝的HBV基因组是在HBV基因组 后连接有HBc和HBx基因。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述扩增制备1.3拷贝HBV基因组并连接到目 的载体上是通过以下方式完成：

取含HBV的样品，用引物PF1、PR1进行PCR扩增，得到分子量约为2.4kb的目的条带 HBV2.4，连接到质粒pMD-18T上保存；

取含HBV的样品，用引物PF2、PR2进行PCR扩增，得到分子量约为1.7kb的目的条带 HBV1.7，连接到质粒pMD-18T上保存；

采用HindIII、XbaI双酶切连接有HBV2.4片段的质粒pMD-18T，XbaI、Pst I双酶切连 接有HBV1.7片段的质粒pMD-18T，Hind III、Pst I双酶切目的载体pUC18，分离纯化酶切后 的目的载体pUC18和HBV2.4片段、HBV1.7片段，然后将HBV2.4片段、HBV1.7片段同时连接 到目的载体pUC18上，即得。

6.检测乙型肝炎病毒复制能力或抗病毒药物敏感性的方法，其特征在于包括以下步骤：

a、用权利要求1所述的引物组从含HBV的样品中扩增制备1.3拷贝HBV基因组并连接到 目的载体上；所述目的载体为不含有外源启动子的载体；

b、用该载体建立HBV转基因复制增殖体系；

c、用该HBV转基因复制增殖体系进行乙型肝炎病毒复制能力或抗病毒药物敏感性的检 测；

本方法非疾病的诊断和治疗方法。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤a扩增制备1.3拷贝HBV基因组并连 接到目的载体上是通过以下方式完成：

取含HBV的样品，用引物PF1、PR1进行PCR扩增，得到分子量约为2.4kb的目的条带 HBV2.4，连接到质粒pMD-18T上保存；

取含HBV的样品，用引物PF2、PR2进行PCR扩增，得到分子量约为1.7kb的目的条带 HBV1.7，连接到质粒pMD-18T上保存；

采用HindIII、XbaI双酶切连接有HBV2.4片段的质粒pMD-18T，XbaI、Pst I双酶切连 接有HBV1.7片段的质粒pMD-18T，Hind III、Pst I双酶切目的载体pUC18，分离纯化酶切后 的目的载体pUC18、HBV2.4片段和HBV1.7片段，然后将HBV2.4片段、HBV1.7片段同时连接 到目的载体上pUC18，即得；

所述的1.3拷贝的HBV基因组是在HBV基因组后连接有HBc和HBx基因。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤b所述的HBV转基因复制增殖体系为肝癌 细胞株HepG2细胞模型、鼠成纤维细胞NIH3T3细胞模型。