[发明专利]一种蛋白质相互作用的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测方法，用于检测蛋白质相信作用，属于生物分子领域。

背景技术

蛋白质相互作用(protein-protein interaction，以下简称“PPI”)，是在维持生物 体的正常生理功能中起重要作用的生理过程，PPI涉及几乎所有的重要生命活动，包括DNA的 复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等等。例如，精确调控和实现细胞生理 功能的信号通路即通过信号分子和对应受体的相互作用来实现信号传导和放大，从而实现细 胞对外部环境刺激的应激反应。此外，多种具有重要功能的蛋白质分子都以二聚体，三聚体 或寡聚体的形式行使作用，这些蛋白间的相互作用对其生理功能实现十分重要。蛋白质相互 作用必须被精确调控，并以此来维持我们机体的正常功能，无序、失控的蛋白质相互作用可 引发癌症或其他严重疾病。

研究蛋白质-蛋白质相互作用，不仅可以从分子水平揭示蛋白质的功能，而且对于研究 生长、发育、分化和凋亡等生命活动规律至关重要，为探讨重大疾病的机理、疾病治疗、疾 病预防和新药开发提供重要的理论基础。生物化学家以及不少公司都在通过研究蛋白之间的 相互作用来揭示信号传递通路中的关键部位，并开发影响信号传递的药物，以达到疾病治疗 目的。其中在生理过程中最为普遍则是两个蛋白之间的相互作用，例如表皮生长因子EGF和 表皮生长因子受体EGFR的相互作用被发现在细胞生长和癌症发生中起到重要的作用。而细胞 信号通路的信号传导和级联放大也是通过如Ras、Raf等蛋白相互作用来实现的。

目前，研究蛋白质间相互作用的主要技术有酵母双杂交系统、免疫共沉淀技术和 pull-down技术等。但这些技术主要在体外或者在非哺乳动物细胞内进行，结果并不直接、 可靠。虽然基于荧光蛋白对的FRET技术(Fluorescence Resonance Energy Transfer)可实 时监测活哺乳细胞内蛋白相互作用的时空动力学，但该方法灵敏度比较低，而且数据处理繁 琐，仪器要求高，限制其对于蛋白相互作用图谱的研究。因此，一种直观，动态，简便，可 操作性强，可在生理条件下实施的研究方法在蛋白质相互作用及其相关疾病的研究中是非常 急需的。

双分子荧光互补技术(BiFC)可实现更直接，更简便的理解蛋白质相互作用及其相关生 理过程。Hu教授于2002年发明的基于GFP荧光蛋白家族的BiFC方法(Bimolecular Fluorescence Complementation)不仅可以检测强相互作用，而且可以高灵敏的检测弱相互 作用。该方法可直接标记目标蛋白，实现在生理条件下的细胞环境(或组织，甚至在体)中 直接观察蛋白质何时，何地，何种强度发生相互作用，可信，充分的说明真实的生理过程， 并且只须普通荧光显微镜即可实现，具有可操作性强的特点。目前已有文献报道利用BiFC技 术研究活细胞内多对蛋白相互作用网络。但利用BiFC方法检测蛋白质相互作用，多用绿色荧 光蛋白，穿透性差，不能解决多对蛋白质相互作用的检测；而已知的红色荧光蛋白( mRFP-Q66T)虽也可以用来进行BiFC研究，但该荧光蛋白不仅亮度相对低，而且对pH不稳定 (pKa＝7.5)，很难在酸性环境中研究蛋白相互作用，不能在生理温度37℃工作，不能同步 并行检测多对蛋白质相互作用，同时不能活体成像检测蛋白质的相互作用。

发明内容

本发明的目的是解决上述问题而提供了一种利用双分子荧光互补技术，基于橙红荧光蛋 白和远红荧光蛋白，检测蛋白质相互作用的方法。

本发明所采用的技术方案是：

一种蛋白质相互作用的检测方法，利用双分子荧光互补技术，基于橙红荧光蛋白，该检 测方法包括以下步骤：

1)将橙红荧光蛋白切割成两个蛋白序列片段，分别为TN和TC，构成红色双分子荧光互 补探针；

2)将两个蛋白序列片段分别构建到两个表达载体中，将待测的两个目标蛋白的DNA序列 分别与TN和TC构建用于表达融合蛋白；

3)利用双分子荧光互补现象，将融合蛋白序列载体共转染细胞，使用光源及光学组件 ，在荧光显微镜观察刺激前后是否存在红色荧光；如果两目标蛋白存在相互作用，则TN和 TC足够靠近，从而自发重组为完整荧光蛋白，产生红色荧光信号；如果没有或者只有极其微 弱红色荧光，证明目标蛋白之间无相互作用。

优选地，所述橙红荧光蛋白为TagRFP。