[发明专利]抗中期因子反义寡核苷酸纳米制剂及其制备与应用

说明书

(一)技术领域

本发明属于抗肝癌药物技术领域，涉及反义寡核苷酸纳米制剂，具体为一种 具有良好应用前景的抗肝癌反义寡核苷酸纳米制剂及其应用。

(二)背景技术

原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一种高侵袭性、高转 移性的实体恶性肿瘤，但还缺乏理想的治疗方法。基因治疗因为缺乏理想的基 因载体而限制了其在临床上的应用。

中期因子(midkine，MK)是一个新发现的促血管生成因子，它是一种具有 促细胞转化、促有丝分裂作用、促肿瘤血管生成、抗细胞凋亡和增强纤维蛋白 溶解等肿瘤形成相关活性的碱性肝素结合性蛋白质，仅在胚胎中期和成年肾脏 表达。已有的研究表明，在肝癌等许多人类肿瘤组织中MK mRNA及蛋白均呈 高度表达，而各种正常组织仅有低水平表达或无表达，并与肝癌的发生、浸润 转移，血管生成及预后密切相关，而血管生成是肝癌无限制侵袭，生长和转移 的基础。因此，MK可能是抗血管生成治疗肝癌的理想靶位。

纳米脂质体是一种定向药物载体，属于靶向给药系统的一种新剂型，可以 将毒副作用大、稳定性差、降解快的药物粉末或溶液包埋在直径为纳米级的脂 质体微粒中，这种微粒具有类细胞结构，可以透过人体病灶部位的血管内皮细 胞间隙到达病灶部位，并改变被包封药物的体内分布，使其在病灶部堆积释放， 从而达到提高药物治疗指数，减少药物治疗剂量和降低药物毒性的目的，以实 现定向给药。

(三)发明内容

本发明的目的在于提供一种制备具有治疗原发性肝细胞肝癌潜能的反义寡 核苷酸纳米药物的方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种抗中期因子反义寡核苷酸纳米制剂，由0.01～500mM的阳离子纳米脂 质体溶液和10～1000μM的抗中期因子反义寡核苷酸溶液按照体积比20∶1～0.1∶1 混合制成，其中抗中期因子反义寡核苷酸的序列为 CCCCGGGCCGCCCTTCTTCA。

所述阳离子纳米脂质体可选用本领域常规阳离子纳米脂质体，本发明中优 选为DC-chol纳米脂质体。

优选的，所述纳米制剂由1.86mM的阳离子纳米脂质体溶液和150μM的抗 中期因子反义寡核苷酸溶液按照体积比1.8∶1混合制成。

本发明还涉及所述的抗中期因子反义寡核苷酸纳米制剂的制备方法，所述 方法包括：

(1)阳离子纳米脂质体制备：将阳离子脂质和中性磷脂溶于有机溶剂中，采用 常规薄膜分散法或逆向蒸发法制备脂质体，加入糖的水溶液，水浴超声波 处理得到含糖3％～30％(w/v)的粗脂质体悬液(脂质体悬液中脂质体浓 度可根据实际需要进行控制)，通过均质机均质、微射流泵、超声或是挤 压器均匀粒径，控制粒径为100～200nm，过滤除菌，得到阳离子纳米脂质 体；分装于西林瓶中，可以在2℃～8℃下保存或冻干保存至使用，所述的 制备脂质体的方法有很多，如薄膜分散法、逆向蒸发法、溶剂注入法、冻 融法等，都可以用来制备空白脂质体。

所述的阳离子脂质体可为3-β-[N-(N’，N’-二甲基氨基乙基)]氨甲酰基 胆固醇(DC-chol)以及类似的胆固醇衍生物，N-[1-(2，3)-二油烯氧基]丙基-N，N，N- 三甲基氯化铵(DOTMA)及其类似物，如1，2-二油烯氧基-3-三甲氨基丙烷 (DOTAP)，还有溴化二甲基双十八烷基铵(DDAB)及其类似的烷基胺/酰胺复 合物中的一种或多种。

所述中性磷脂选自二油酰磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂、卵磷脂中的一种或多 种；磷脂种类繁多，但制备脂质体的方法大同小异，本发明所用的中性磷脂不 局限于以上所举实例。

所述的有机溶剂选自氯仿、甲醇、乙醇、叔丁醇、异丙醇和正丁醇中的一 种或多种的混合；

所述的糖选自乳糖、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、海藻糖、绵白糖中的一种或 多种；

(2)纳米制剂制备：0.01～500mM的阳离子纳米脂质体溶液和10～1000μM的 抗中期因子反义寡核苷酸溶液按照体积比为20∶1～0.1∶1混合后静置10min 以上，制得所述的抗中期因子反义寡核苷酸纳米制剂。

所述阳离子脂质与中性磷脂摩尔比为4～7∶3～6。