[发明专利]一种高效分泌表达重组角质酶的基因工程菌及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种高效分泌表达重组角质酶的基因工程菌及其构建方法，属于 生物工程技术领域。

背景技术

角质酶是一种多功能酶，可水解各种可溶性酯类、乳化的甘油三酯、不溶 性脂肪酸酯、不溶性多聚体角质等，广泛用于洗涤剂、食品、农业、化学工业 中，尤其在纺织工业中，可用于棉纤维的生物精炼以及合成纤维对苯二甲酸乙 二酯(PET)的改性，目前上述两种工艺均采用传统碱处理工艺，存在水耗、能 耗大，对纤维损伤大，环境污染等缺陷，因此，酶法处理工艺作为一种节能减 耗的环境友好技术，将成为染整行业发展的趋势。目前对角质酶的研究集中在 真菌角质酶上，但存在表达量低、热稳定性差等问题。本研究室前期研究中对 嗜热放线菌(Thermobifida fusca WSH03-11)角质酶进行了基因鉴定，分泌表 达并对其酶学性质进行了深入的研究，表明它较真菌角质酶具有明显优势(陈坚， 吴敬，陈晟.一种耐热角质酶及其编码基因和表达.申请号200710026074.2)。

大肠杆菌(Escherichia coli)遗传背景清楚，培养周期短，操作简单，是目 前应用最广泛、最成功的外源重组蛋白表达系统。外源重组蛋白在E.coli中合 成后可定位在胞内、周质空间、胞外。由于胞外分泌表达有助于蛋白质的正确 折叠，减少包涵体的形成，避免胞内蛋白酶的降解，而且大大简化下游纯化过 程，因此在大规模工业化生产中具有绝对优势。大肠杆菌中存在5种分泌途径， II型分泌途径在外源重组蛋白分泌表达中应用最普遍，II型分泌途径为“两步过 渡式”，先介导蛋白跨内膜于周质，再跨外膜实现胞外基质分泌。大肠杆菌绝大 部分自身蛋白跨膜转运使用II型分泌途径中由SecB介导的Sec分泌途径，因此 目前绝大部分外源重组蛋白也常采用Sec途径进行分泌表达。

与II型分泌途径相比，I型分泌途径为“一步介导式”，直接介导蛋白从胞 内分泌至胞外。I型分泌途径组成简单，只包含3种转运蛋白hlyB、hlyD和TolC， 其中hlyB、hlyD为该途径特有的内膜蛋白，TolC为位于外膜的多系统通用组分， 三者可形成连接内外膜的跨膜通道，将C端连接α-溶血素信号肽的重组蛋白不 经过周质空间而直接分泌至胞外。但I型分泌途径也有两个不可避免的缺点： 第一，信号肽在分泌过程中不被切除，重组蛋白在分泌至胞外后仍然连接信号 肽，需要切除才能获得天然蛋白；第二，通常需要共表达相关系统元件来提高 分泌效率，但这会加重宿主的代谢负担，往往导致表达量低(F.J.M.Murgulhao， D.K.Summers，G.A.Monteiro，Recombinant proten secretion in Escherichia coli，Biotechnology Advances 23(2005)177-202)。因此，各国科研工作者，很少 采用此途径构建高效分泌表达外源蛋白的基因工程菌。

近年来关于发酵法生产角质酶的报道较多，陈晟采用大肠杆菌II型分泌途径中的 Sec途径对Thermobifida fusca WSH03-11角质酶进行了分泌表达，胞外产酶为 180U/mL(Chen S，Tong X，Woodard RW，Du GC，Wu J，Chen J，Identification and Characterization of Bacterial Cutinase，The Journal of Biological Chemistry，2008， 283(28)25854-25862)。张芙华采用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis WSHB06-07) 发酵生产角质酶，通过一系列发酵过程的优化策略，胞外酶活达170U/mL(张 芙华，陈晟，张东旭，华兆哲，陈坚，吴敬，pH两阶段控制策略发酵生产重组 角质酶，中国生物工程杂志，2008，28(5)，59-64)。虽然国内外市场对角质酶 需求量较大，但市场上未见商品化的角质酶产品，其主要原因在于原有菌种角质酶表达量 低，市场上迫切需要一株角质酶高产菌。

发明内容

本发明要解决的一个技术问题是提供一种高效分泌表达重组角质酶基因 工程菌的构建方法。

为解决上述问题，本发明的技术方案是：分别构建2个重组质粒 hlyBD/pSTV28和Tfu_0883-hlyAs/pET20b(+)，分步转化大肠杆菌BL21 (DE3)，通过抗生素筛选得到高效分泌表达重组角质酶的基因工程菌。

具体过程如下：