[发明专利]一种检测人类DNA修复酶基因多态性的芯片及其制备

说明书

技术领域

本发明涉及一种人类DNA修复酶基因多态性的芯片及其制备，尤其涉及一种能同时检测XRCC1 Arg194Trp、Arg399Gln位点和XPD Asp312Asn位点基因多态性的玻璃基因芯片及其制备方法。 

背景技术

基因芯片是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律的排列固定于固相支持物上，然后与待测的标记的核酸样品按碱基配对原理进行杂交，再经过一定的检测系统对杂交信号进行检测，并配以计算机系统对每一杂交信号进行数据分析和处理，从而迅速得出所要的信息。与传统的杂交技术相比，该技术具有微型化、高灵敏性、高度平行性，和高速性的显著特点。其发展速度和其中所运用的技术令人瞩目。迄今为止，已在基因表达检测，基因突变检测，单核苷酸多态性和DNA序列测定等方面展开了广泛的研究和应用。 

机体细胞DNA遭受环境理化因子(如电离辐射和化学物质)或由正常和异常细胞代谢产物(如氧自由基)的袭击，可引起不同类型的损伤：碱基和脱氧核糖变化、DNA链间交联和(或)DNA-蛋白质交联、DNA单链和双链的断裂。DNA修复则是对损伤的主要生物学反应，促使DNA中损伤的、不合适的或错配的碱基恢复本来的生物化学过程，维持遗传物质稳定。机体DNA修复能力差者更易于罹患恶性肿瘤等严重疾病以及对铂类化疗药物更为敏感。研究表明，体内DNA修复酶类活性受基因表达所控制，并且与基因序列上极小的遗传差异即单核苷酸多态性有关。因此了解机体DNA修复酶类基因的遗传变异，对DNA损伤修复能力的遗传风险进行科学、客观地评估具有重要意义。 

XRCC1是一种重要的DNA修复基因，对维持基因组稳定具有关键作用。XRCC1蛋白通过与聚合酶β、DNA连接酶III和多聚ADP核糖聚合酶形成复合物(PARP)，参与因电离辐射和氧化损伤引起的碱基切除修复和单链断裂修复。研究发现在XRCC1194密码子和399密码子处具有2个单核苷酸多态，分别引起C→T和A→G碱基突变，导致相应氨基酸残基的改变：Arg194Trp和Arg399Gln。这些突变使XRCC1在人体形成3种基因型：野生型、突变型和杂合型。Arg194Trp发生在与DNApolβ和PARP作用域之间的连接区，而Arg 399Gln突变是在COOH端与PARP作用域，即BRCT1域。由于发生在多蛋白复合体的蛋白质交界面上残基与活性中心相关残基在酶功能中有一定作用，这些多态性可能会导致蛋白质活性的改变。XPD基因产物是一个由760个氨基酸构成的蛋白质，该蛋白具有ATP依赖的5′→3′DNA解旋酶，参与NER和基因转录，XPD基因312密码子G→A碱基存在着遗传多态性，可导致其产物具不同的生物学活性，使人群DNA损伤的修复能力存在明显的差异。 

目前对于基因多态性检测，已经建立的技术有， 

1DNA测序法：PCR扩增包含突变位点的一段基因序列，利用DNA测序仪进行测序分析，缺点是测序价格昂贵，只能逐个基因进行检测，不适合对多个基因同时进行检测。 

2聚合酶链-限制性长度多态性(PCR-RFLP)法：目前最为常用，主要为采用PCR扩增包含突变位点的DNA片段，然后将待检测的DNA片段用限制性内切酶酶切，限制性内切酶识别并切割特异的序列，然后将酶切后的产物进行电泳，再由限制酶图谱(restriction map)分析此段序列的特异切位点，即由片段的多样性来比对不同来源基因序列的差异性。此方法费用不高，但是操作步骤繁琐，费时费力。 

3聚合酶链-单链构象多态性(PCR-SSCP)法：采用PCR扩增包含突变位点的DNA片段，变性后进行聚丙烯酰胺电泳，银染后观察结果。因其检测敏感，快速和所需装置简便而在分子生物学各个领域广泛应用。但该方法的试验结果受多种因素的影响，如：温度，电压，PAGE胶的浓度和交联度等，重复性较差。 

4变性的高效液相色谱检测(denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC)法：采用PCR扩增包含多态性位点的DNA片段，加热变性后缓慢复性，将样品置于色谱仪的96孔板上，输入DNA序列，根据软件计算提示选择最佳运行温度，在色谱图中判断不同的基因突变类型。此方法灵敏度较高，可以搜寻未知的SNP位点，但是无法对已知SNP实现100％检出。 

然而，上述检测方法存在一个共同的缺点：通量低，即一次检测反应仅能检出一种基因一个位点的基因多态性，而不能进行多个基因的检测。 

经检索，利用DNA修复酶基因多态性检测的玻璃基因芯片，至今未见报道。 

发明内容