[发明专利]一种制备别藻蓝蛋白三聚体荧光蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术中荧光蛋白质材料领域，具体涉及一种制备别藻蓝蛋白三聚体荧光蛋白质的方法。

背景技术

藻胆蛋白主要存在于原核的蓝藻、真核的红藻、隐藻和甲藻(Pyrrophyta)中。根据吸收光谱的不同，可将藻胆蛋白分为4大类：藻红蛋白(phycoerythrin，PE)，藻红蓝蛋白(phycoerythrocyanin，PEC)，藻蓝蛋白(phycocyanin，PC)和别藻蓝蛋白(allophycocyanin，APC)。藻胆蛋白脱辅基蛋白含有α和β亚基，藻胆蛋白中结合的色基称为藻胆素(phycobilin)，藻胆素的A或D环，或A、D两环同时与脱辅基蛋白的半胱氨酸残基通过硫醚键共价连接。藻胆素与脱辅基蛋白共价结合形成特定的构象，使得不同种类的藻胆蛋白呈现不同的光学特性。藻红蛋白主要吸收约560nm的可见光，发射光约580nm的荧光；藻红蓝蛋白吸收约570nm的可见光，发射光约630nm的荧光；藻蓝蛋白吸收约620nm的可见光，发射光约640nm的荧光；别藻蓝蛋白吸收约650～660nm的可见光，发射光约660～670nm的荧光。

别藻蓝蛋白是藻胆蛋白中结构较为简单的蛋白，由α和β亚基紧密结合构成异二聚体(通常称为单体)，每个亚基只结合一个色基。三个单体通过非共价作用结合为三聚体(αβ)₃。别藻蓝蛋白由单体结合为三聚体，其光谱特性经历巨大的变化。通常其单个亚基或单体的可见光吸收光谱峰值为620nm左右，而三聚体则红移至650nm，并在620nm处出现肩峰。同时其荧光发射光谱也发生变化，峰值由单体的640nm红移至三聚体的660nm。目前认为别藻蓝蛋白的单体和三聚体光谱学特性的变化是由于三聚体结合后引起其色基的周围环境变化引起的。

藻胆蛋白具有提高人体免疫力，促进动物细胞再生的功能；可以抑制癌细胞生长，减轻肿瘤化疗的副作用；同时也是一种无毒副作用的理想的光敏剂；藻胆蛋白作为一种天然色素，也可以应用于食品和化妆品中。由于有强烈的荧光特性，藻胆蛋白还可以制备成荧光探针，在免疫学、细胞生物学和分子生物学研究中有着广泛的应用。

目前，中国专利“一种制备别藻蓝蛋白荧光蛋白质的方法，200710029673.X，2007.8.9”，提供了一种利用基因工程方法生产重组别藻蓝蛋白的方法，但得到的荧光类蛋白质仅为别藻蓝蛋白的α亚基。别藻蓝蛋白的α亚基的光谱性质与天然存在的别藻蓝蛋白有明显差别，并且荧光强度较低，得到的重组荧光类藻蓝蛋白水溶性和稳定性也较差，不利于进一步的开发研究。

发明内容

本发明目的在于，提供一种制备别藻蓝蛋白三聚体荧光蛋白质的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种制备别藻蓝蛋白三聚体荧光蛋白的方法：首先将别藻蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白基因与藻胆素生物合成酶基因ho1和pcyA克隆到一个表达载体中；其次将别藻蓝蛋白β亚基脱辅基蛋白基因与色基裂合酶基因cpcS和cpcU克隆到另一个载体上，将两个表达载体同时转化大肠杆菌，筛选出同时表达上述基因的工程菌，即为别藻蓝蛋白三聚体荧光蛋白。

所述别藻蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白基因与藻胆素生物合成酶基因ho1和pcyA克隆载体为pCDFDuet；别藻蓝蛋白β亚基脱辅基蛋白基因与色基裂合酶基因cpcS和cpcU克隆载体为pRSFDuet。所述别藻蓝蛋白三聚体荧光蛋白采用Ni柱亲和吸附，凝胶色谱法脱盐，蛋白浓缩及凝胶色谱分离，即得到纯化后的别藻蓝蛋白三聚体荧光蛋白。所述别藻蓝蛋白脱辅基蛋白基因是指Synechocystis sp.PCC6803或与其同源的基因。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1.不使用藻类为原料而是利用大肠杆菌生产重组光活性蛋白，大肠杆菌易于培养，生长快，可以大大缩短生产周期；与藻类相比，大肠杆菌细胞壁易于破碎，纯化过程可以节约能源，利用率高。

2.菌种较稳定。得到的重组蛋白含有His-tag标记，体系中没有类似蛋白，通过离子螯合色谱一步纯化便可获得目的蛋白，且纯度较高。

3.可以规模化发酵生产一种新型重组光活性蛋白，最大吸收波长为650nm，最大发射光波660nm，具有优良的荧光性质，可用于新型荧光探针领域；为藻胆蛋白类色素蛋白质功能材料应用于食品、化妆品、医药和生物工程领域提供了一种简单有效的新方法。

附图说明

图1本发明制备别藻蓝蛋白的示意图；