[发明专利]使用菲涅尔双棱镜产生多层光片的荧光显微方法及装置

说明书

技术领域

本发明涉及一种荧光显微方法及装置。

背景技术

在生命科学研究中，为了从微观上研究活体的生命活动，要求显微像成装 置具有高时间和空间分辨率以及三维成像能力。活体光学显微成像近年来成为 生物医学光学研究中最为活跃的领域之一。

荧光显微成像因其操作简便且直观而成为活体成像研究的一种理想方法。 利用这种成像技术，可以实时观察荧光标记的基因及细胞在活体动物体内的活 动及反应。荧光显微主要包括普通的宽视场(wide-field)荧光显微，激光共聚 焦荧光显微以及多光子荧光显微。普通的宽视场荧光显微具有成像速度快，结 构简单的优点，它使用白光源加滤光片作为激发光，并利用聚光镜或显微物镜 本身将激发光聚集到样品上，样品被均匀照明，可使用目镜观察或CCD相机 拍摄荧光图像，但由于整个样品都被激发并且没有光阑的限制，样品的离焦部 分会带来很大的背景噪声，因此该技术不具有三维层析成像能力。激光共聚焦 荧光显微技术采用点扫描技术将样品分解成二维或三维空间上的很多点，用高 度聚焦的激光束逐点逐行扫描成像，激发出的荧光经过探测针孔滤波后被光 电倍增管探测收集，并将信号输送到计算机，通过软件重新组合生成一个整体 平面的或立体的像。由于只有在焦平面上的光才能穿过探测针孔，焦平面以外 区域射来的光线不能通过针孔，所以激光共聚焦荧光显微技术可以实现高分辨 率三维层析成像。多光子荧光显微与激光共聚焦显微在结构上非常类似，也是 通过光束扫描实现三维成像，它利用的是荧光染料的多光子吸收特性，由于这 种非线性光学效应只有在激光焦点处才能激发荧光，所以不需要探测针孔。多 光子荧光显微的优点是它通常使用近红外波长的激光，因此在生物组织内具有 比较大的穿透深度。但由于激光共聚焦显微和多光子荧光显微都采用点扫描的 成像方式，因此成像速度比使用CCD相机的普通的宽视场荧光显微要慢很多， 不能适用于某些要求高速实时观察的活体光学显微成像。另外，当荧光染料被 过度激发后会失效，这就是光漂白效应(photobleaching)，激光共聚焦荧光显 微和多光子荧光显微具有很强的光漂白效应，在共聚焦荧光显微中，探测针孔 会挡住离焦部分的荧光信号而只让焦点处的荧光信号通过并被探测器接收，大 部分的荧光信号不会被探测但是依然会对样品产生漂白作用(这种情况在3D 成像时尤为明显)。多光子荧光显微利用荧光染料的多光子吸收发射荧光，这 是一种非线性光学效应，需要很高的激光能量，因此对样品的光漂白作用会更 加明显。这样一来，逐点扫描完整个样品有可能会产生严重的光漂白效应，而 且有可能对活体生物组织带来损伤。

单层光显微(light sheet microscopy)这项最近才被提出的新技术能对毫 米量级的活体样品进行实时荧光成像。如图1所示，单层光显微也是一种宽视 场荧光显微技术，使用CCD采集图像，具有普通宽视场荧光显微成像速度快 的优点，区别是它使用柱面透镜对平行光束聚焦，在柱面透镜的焦平面附近会 产生一个近似于光片(light sheet)的光场分布。如果用来照射样品，只有位于 光片内的荧光染料才能被激发，样品的其他部分没有被激发，因此也不会带来 背景噪声。如果将这个光片在样品中垂直移动，并利用CCD相机同步采集激 发的荧光图像，最后再通过软件重组，就可以得到整个样品的三维图像。单层 光显微技术具备普通宽视场荧光显微技术不具备的三维层析成像能力，并且这 种光片激发的照明方式更加合理地利用了激发光，也大大减弱了荧光漂白效 应。该技术已经成功用于观察细小生物体和胚胎组织。有资料表明，在对胚胎 组织的3D成像中，单层光片显微需要光能是共聚焦显微需要激光能量的1/10³， 是多光子显微需要的激光能量的1/106。2008年，欧洲分子生物实验室(EMBL) 的Stelzer小组使用单层光显微技术观察斑马鱼胚胎在24小时内的发育状况， 并获得了数千个细胞的整体图像。

但是单层光显微技术也有其明显缺点，如图2(a)所示，由于采用柱面透 镜聚焦，在柱面镜的焦平面处的光场分布并不是严格意义上的光片，它有一定 的发散角，发散角的大小与柱面镜的焦距成反比。从图2(b)还可以看出，光 片内的光强度分布也是不均匀的。另外，由于样品散射等原因，这个光片光场 在样品内不会有很深的穿透距离，所以当样品比较大或者散射比较强的时候， 就需要旋转样品从而得到不同角度的图像，最后再利用软件进行图像拼接，这 样一来会减慢系统的图像采集速率。

发明内容