[发明专利]一种基于金磁微粒进行免疫沉淀反应的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于磁性微粒进行免疫沉淀反应的方法。

背景技术

免疫沉淀(Immunoprecipitation，IP)是以抗体-抗原的特异性亲和作用 为基础，用于沉淀或分离纯化目的蛋白，或研究蛋白质，DNA或RNA与目的蛋 白质的相互作用的方法。其原理是：在血浆/清，脑髓液，唾液、腹水、组织培 养物，杂交瘤上清和细胞裂解液中，有许多蛋白质-蛋白质，DNA-蛋白质，RNA- 蛋白质间的相互作用，如果用目的蛋白的抗体免疫沉淀目的蛋白，那么与目的 蛋白在体内结合的物质也能沉淀下来。这种方法包括用来分离生物样本中的已 知特定蛋白质的个别免疫沉淀法(IP)；用于研究整个蛋白质复合体，测定两种 目标蛋白质是否在体内结合，确定一种特定蛋白质的新作用搭档的免疫共沈淀 法(Co-IP)；用来研究与DNA结合的蛋白质的染色质免疫沉淀法(ChIP)；用来研 究与RNA结合的蛋白质的RNA免疫沉淀法(RIP)。

免疫沉淀试验的方法是在生物样品中先加入抗体免疫沉淀反应后再加进固 定了蛋白A/G的载体分离，或加入固定了抗体的载体进行免疫沉淀反应后分离。

目前现有的以琼脂糖凝胶微球为载体的方法，需要经过层析、离心等步骤。 层析柱需要一定的活化时间及前处理步骤，并且所需反应体积较大，之后还需 样品的浓缩，对小体积样品处理时不能得到理想的结果，同时离心的方法耗时 耗力且容易造成样品损失。而现有技术中以金磁微粒为载体的免疫沉淀方法是 通过对抗体采用共价偶联的方法固定到载体上，虽然可以实现免疫沉淀试验的 目的，但存在非特异性结合、重现性差，同时抗体的活性造成了一定的损失， 选择种类少的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于金磁微粒进行免疫沉淀反应的方法，其解 决了现有免疫沉淀方法中有非特异性结合、重现性差的问题。

本发明的技术解决方案是：

本发明基于金磁微粒进行免疫沉淀反应的方法，它的实现步骤包括：

(1)抗体的固定：选取金磁微粒作为反应的固相载体，将目标生物物质的特异 性抗体直接偶联在金磁微粒的表面；所述将目标生物物质的特异性抗体偶联在 金磁微粒表面的方法包括：

(1.1)金磁微粒预处理：

取金磁微粒，置于磁性分离器上，磁性分离，弃上清；加入偶联缓冲液， 轻摇重悬，置于磁性分离器上，磁性分离，弃上清，即得到预处理好的金磁微 粒；

(1.2)偶联抗体：

取目标生物物质的特异性抗体，加入偶联缓冲液稀释，再加入至预处理好 的金磁微粒中，置于摇床中，0～37℃条件下，充分反应10min～30min，磁 性分离，弃上清；加入清洗缓冲液，轻摇重悬，磁性分离，弃上清；加入保存 缓冲液，2～8℃保存备用。

(2)稀释目的生物样品：

取目的生物样品，加入反应缓冲液稀释，保存备用。

(3)免疫沉淀反应：

(3.1)前处理：

取上述步骤(1)中固定了目标生物物质的特异性抗体的金磁微粒，置于磁 性分离器上，磁性分离，弃上清；

(3.2)反应：

加入上述步骤(2)中稀释好的目的生物样品，混合均匀，0～37℃条件下， 充分反应5min～60min，磁性分离，弃上清，即为含有免疫沉淀复合物的磁性 微粒复合物；

(4)免疫沉淀复合物的洗脱：

取上述步骤(3.2)中的磁性微粒复合物，加入洗脱缓冲液，混合均匀，0～ 37℃条件下，充分反应5min～60min，磁性分离，移取分离后上清，即为所需 的免疫沉淀复合物。

上述的基于金磁微粒进行免疫沉淀反应的方法，其特征在于，它的实现步 骤还包括目标生物物质的特异性抗体的亲和配体的固定：

在将目标生物物质的特异性抗体加入预处理好的金磁微粒中偶联之前，先 加入目标生物物质的特异性抗体的亲和配体，0～37℃条件下，充分反应10 min～30min，磁性分离，弃上清；再加入清洗缓冲液清洗，磁性分离，弃上清

上述的基于金磁微粒进行免疫沉淀反应的方法，其特征在于，所述方法包 括磁性微粒的再生和保存步骤：

用再生缓冲液清洗上述步骤(3.2)免疫反应后的金磁微粒，将吸附到金磁 微粒上的目标生物物质的特异性抗体从金磁微粒上洗脱下来，得到再生后的金 磁微粒，再加入保存缓冲液，2℃～8℃保存备用。