[发明专利]一种同时检测三类镰刀菌毒素的快速分子检测方法与应用

说明书

(一)技术领域

本发明“一种同时检测三类镰刀菌毒素的快速分子检测方法与应用”，专用于检测三种类镰刀菌毒素，属于植物检疫技术领域，与分子检测技术有关。

(二)背景技术

由镰刀菌引起的赤霉病(Fusarium head blight or scab)是危害小麦、大麦、燕麦、玉米、水稻、黑麦等多种禾谷类作物的一种重要病害，广泛分布于世界温暖潮湿地区。19世纪90年代，北美、欧洲、亚洲等地大麦、小麦赤霉病暴发成灾；近些年来，我国小麦赤霉病也越来越严重，几乎蔓延到全国所有的小麦种植区，造成严重的产量损失和品质的大幅下降。除此之外，更为重要的是镰刀菌产生的毒素能够使人畜中毒，严重威胁人畜健康，造成食品安全上的重大隐患。欧美许多国家的啤酒和饲料加工企业明确提出所收购的大麦容忍零毒素，我国也明确规定收购的大、小麦赤霉病粒率不得超过4％。

镰刀菌可以产生单端孢霉烯族毒素(trichothecene)，他可以抑制真核细胞蛋白质的合成，破坏人畜的免疫系统，使中毒者出现腹泻、呕吐和头晕等症状，而赤霉病麦中毒是我国最主要的真菌毒素导致的食物中毒之一。在我国，禾谷镰刀菌是赤霉病的主要病原菌(Fusariumgraminearum Schwabe)，近些年研究表明F.graminearum是一个含有许多特定种系的复合种(Fg complex)，O’Donnell通过宗系谱法将Fg complex划分成12个特定的正式命名的种。禾谷镰刀菌产生B型单端孢霉烯族毒素毒素，主要包括雪腐镰刀菌烯醇(nivalenol，简称NIV)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，简称DON)，其中DON毒素又具有两种衍生物，分别为3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-Acetyldeoxynivalenol，简称3ADON)和15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-Acetyldeoxynivalenol，简称15ADON)。由于这三种镰刀菌毒素严重威胁到人类和动物的安全，国内外育种界、病理学界、医学界以及各国政府检验检疫部门对这三种毒素的监测监控研究十分重视。

镰刀菌毒素的检测主要有生物测定法、化学测定法、酶联免疫吸附法、特异性聚合酶链式反应等手段。生物测定法由于没有统一的规范标准，并且有易污染、检测分析不准确以及与毒素互作机制复杂等缺点，所以在实际镰刀菌毒素含量检测中未能得到广泛应用。化学测定法是目前用于镰刀菌毒素定量测定的主要方法，具有是快速、准确、重演性好的优点。但其纯化程序比较费时和复杂，技术含量要求也较高，不能满足口岸快速检测的要求。酶联免疫吸附法操作简单，费用较低，但因为检测出的毒素中常含有一些其它衍生物，所以测定的结果往往偏高。而且目前已有商品化的只有快速检测DON毒素的ELISA试剂盒，还没有检测NIV的试剂盒问世，也不能区分DON毒素的两种衍生物。根据美国农业部Ward博士的最新报道，产生3ADON的镰刀菌具有更强的产孢率和生长速率，对麦类作物的危害更为严重，并且正在取代产生其他毒素的镰刀菌，表现出更强的适应性(Ward，T.J.et al.2008.An adaptiveevolutionary shift in Fusarium head blight pathogen populations is driving the rapid spread of moretoxigenic Fusarium graminearum in North America.Fungal Genet.Biol.45：473-484.)。在中国，我们也发现了类似的情况(Zhang et al.2009.Population genetic analysis of Fusarium asiaticumpopulations from barley suggest a recent shift favoring 3ADON producers in southern China.Unpublished)。所以对于3ADON和15ADON的检测也是十分必要的。随着近年来国际贸易中各国之间粮食进出口规模不断扩大，各国口岸都加强了对粮食作物的出入境管理，检疫实践中急需一种套快速、简单、灵敏的检测方法来检测进出口粮食是否存在毒素污染。