[发明专利]具有抑制血小板凋亡活性的一种穿膜糖蛋白寡肽或其修饰物/衍生物及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种新的合成的可穿膜寡肽，其氨基酸序列及其抑制GPIb-IX与VWF结合诱导的血小板凋亡的能力。

本发明属于分子生物学和血液病学范畴。

背景技术

细胞凋亡是生命的基本特征之一，是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，由基因控制的细胞自主性死亡过程。细胞正常的凋亡功能是维持机体正常生长发育和内环境稳定的前提，凋亡失衡可导致许多疾病的发生。

血小板是参与血栓、特别是动脉血栓形成的主要有形成份。近几年的研究发现，血小板同样表达死亡受体、半胱氨酸蛋白酶caspases及Bcl-2蛋白家族等凋亡调控蛋白，可发生凋亡。机体内血小板凋亡可能引起皮肤、黏膜、内脏出血为特点的疾病。血栓性血小板减少性紫癜(TTP)是一种少见的微血管血栓-出血综合症，该病起病急骤，常于短期内死亡，至今仍是一种潜在致死性疾病。TTP的主要病理特征为血小板减少、贫血，可引起脑部等广泛性继发出血。TTP的发病机制目前认为是患者有广泛的微血管内皮细胞损伤导致释放大量异常的超大分子量血管性血友病因子(uLVWF)多聚体，与VWF多聚体相比，uLVWF与血小板表面的VWF膜糖蛋白(Glycoprotein，GP)Ib-IX受体具有更高的亲和性，在血流剪切力的作用下uLVWF与GPIb-IX的结合介导血小板的粘附与聚集，促进循环中的血小板形成微血栓，导致大量血小板消耗性减少。研究显示，病理情况下，血小板GPIb-IX复合物与VWF的结合使得血小板以滚动方式粘附在损伤的血管内皮表面，与此同时，启动血小板细胞信号转导机制，导致血小板内发生Ca⁺⁺浓度增加，蛋白质磷酸化，PI3K、PKC活化，ADP释放等一系列反应，从而诱导血小板表面另一受体GPIIb/IIIa(integrin alpha IIb beta3)的活化，活化的GPIIb/IIIa与血浆中纤维蛋白原结合，最终导致血小板相互聚集成团，形成血小板血栓，因此，血小板表面GPIb-IX与VWF的结合是血小板参与血栓形成、止血的起始关键步骤。我们的最新研究表明，GPIb-IX受体与VWF的结合不仅可以诱导血小板的活化和聚集反应，同时可以启动血小板胞内凋亡信号，诱导血小板凋亡的发生，此过程中细胞内信号分子14-3-3蛋白与GPIbaC胞质结构域的结合起着关健作用。

血小板表面凋亡标志物磷脂酸丝氨酸(PS)的表达是内皮网状系统识别并清除循环中凋亡血小板的标志，因此，除了血小板血栓形成以外，GPIb-IX与VWF结合诱导的血小板凋亡

可能是导致TTP患者体内血小板减少的另一主要机制。有效抑制血小板的减少，是治疗TTP疾病的一个基本思路和有效途径。目前国内外临床上常用血浆置换、抗血小板药物等抑制血小板活化的方法治疗TTP疾病，基于我们已有的研究基础，以抑制GPIba与VWF结合诱导的凋亡发生为靶标，创制一种可抑制血小板的始动凋亡途径，从而抑制血小板减少或活性丧失的新型抗血小板凋亡药物，必将会对TTP疾病的治疗产生意想不到的效果，同时亦可有望提高医用血小板体外储存期。在GPIb的胞质结构域，已知有3个14-3-3蛋白结合位点，分别为GPIba 609位点，GPIba 587-590位点和GPIbβ166位点，这些位点都是以磷酸化Ser为中心的结构域。其中GPIba 609位点的存在是14-3-3蛋白与GPIb稳定结合的前提。本发明在现有研究基础上，本室研究创建了新的可穿膜寡肽。

发明内容

本发明目的：合成新的可穿膜寡肽，对其抑制血小板凋亡的功能进行研究验证，最终创制一种具有自主知识产权，可有效抑制血小板凋亡，对TTP等血小板减少疾病的治疗以及提高医用血小板体外储存期具有潜在应用价值的新型药物。

技术方案：本发明分别应用瑞斯托霉素和高剪切力诱导血小板GPIb-IX受体和VWF的结合，流式细胞术和Western-blot技术检测血小板与VWF的结合情况及血小板凋亡指标；瑞斯托霉素分别诱导VWF与表达GPIba野生型(1b9)、GPIba-551(不含GPIba-551氨基酸以后的C-末端序列，Δ551)和GPIba-609A(GPIba 609位点Ser突变为Ala，S609A)三种细胞株结合，检测各细胞株的凋亡指标；基于GPIba胞质C-末端氨基酸序列(GPIba 605-610位点)设计合成新的GPIba 609Ser磷酸化可穿膜寡肽，瑞斯托霉素诱导血小板GPIb-IX和VWF的结合实验对可穿膜寡肽功能进行研究。结果表明可穿膜寡肽可有效抑制GPIb-IX与VWF结合诱导的血小板凋亡。