[发明专利]一种检测不同亚型禽流感病毒的方法及其专用试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测不同亚型禽流感病毒的方法及其专用试剂盒。

背景技术

PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)技术是一种20世纪八十年代处发展起来的分子生物学技术，用于富集特定的DNA片段。它运用从温泉细菌中分离出的DNA聚合酶(DNA Polymerase)，通过变性、复性(退火)和延伸等三步反应，模拟体内DNA复制。能够将极微量的核酸在短时间内迅速扩增复制，获得大量的目的DNA片段。

PCR扩增完成后需要通过鉴定，才能确定是否真正准确可靠获得了预期扩增产物，琼脂糖凝胶电泳是实验室最常用的，简便易行。核酸分子带负电，在电场下向正极运动，不同分子大小的核酸带电量不同，在凝胶介质的分子筛作用下，使分子大小不同的核酸分子出现不同的迁移率，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入染料，在凝胶分析系统中进行分析。

琼脂糖凝胶电泳的浓度通常在0.5-2％之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来分离小片段的电泳。比如实验室常用的1％的琼脂糖凝胶电泳可以分辨的核酸大小为0.5kb-7kb，2％的胶可以分辨0.1kb-3kb的核酸。由此可见，其分辨率不高，当核酸片段大小相近(或相同时)就无法区分，在电泳中这几条分子大小相近的条带就可能只显现出一条带。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测不同亚型禽流感病毒的方法及其专用试剂盒。

本发明提供的检测待测生物样本中是否含有DNA片段甲和/或DNA片段乙的双色荧光多重PCR(DFM-PCR，Dual Fluorescence Multiplex-PCR)方法，包括如下步骤：将待测生物样本的总DNA作为模板，用引物对甲和引物对乙进行多重PCR；将多重PCR的产物进行琼脂糖凝胶电泳，用荧光成像分析仪分别在532nm和635nm下进行凝胶扫描分析；如果635nm下具有荧光条带，待测生物样本中含有DNA片段乙，如果532nm下具有荧光条带，待测生物样本中含有DNA片段甲；引物对甲的5’端用Tamra标记，引物对乙的5’端用Cy5标记；所述引物对甲用于扩增DNA片段甲；所述引物对乙用于扩增DNA片段乙。

所述琼脂糖凝胶电泳具体可为0.5-2％(质量百分含量)琼脂糖凝胶电泳，如0.5-1％(质量百分含量)琼脂糖凝胶电泳、1-1.5％(质量百分含量)琼脂糖凝胶电泳、1.5-2％(质量百分含量)琼脂糖凝胶电泳等。当所述琼脂糖凝胶电泳为1％(质量百分含量)琼脂糖凝胶电泳时，所述DNA片段甲和所述DNA片段乙相差7000bp以下，具体可相差500bp以下。当所述琼脂糖凝胶电泳为2％(质量百分含量)琼脂糖凝胶电泳时，所述DNA片段甲和所述DNA片段乙相差3000bp以下，具体可相差100bp以下。本发明的方法的灵敏度远远高于常规DNA检测所用的的琼脂糖凝胶电泳-SYBGreenI染色法。

所述双色荧光多重PCR方法可应用于检测待测生物样本中是否含有H3亚型禽流感病毒和/或H6亚型禽流感病毒。

本发明还保护一种检测待测生物样本中是否含有H3亚型禽流感病毒和/或H6亚型禽流感病毒的方法，包括如下步骤：将待测生物样本的cDNA为模板，用引物对A和引物对B进行多重PCR，将多重PCR的产物进行琼脂糖凝胶电泳，用荧光成像分析仪分别在532nm和635nm下进行凝胶扫描分析；如果635nm下具有荧光条带，待测生物样本含有H3亚型禽流感病毒；如果532nm下具有荧光条带，待测生物样本含有H6亚型禽流感病毒；所述引物对A是序列表的序列11所示核苷酸和序列表的序列12所示核苷酸组成的引物对，序列12所示核苷酸的5’端用Tamra(TAMRA)标记；所述引物对B是序列表的序列3所示核苷酸和序列表的序列4所示核苷酸组成的引物对，序列4所示核苷酸的5’端用Cy5标记。所述琼脂糖凝胶电泳具体可为0.5-2％(质量百分含量)琼脂糖凝胶电泳，如0.5-1％(质量百分含量)琼脂糖凝胶电泳、1-1.5％(质量百分含量)琼脂糖凝胶电泳、1.5-2％(质量百分含量)琼脂糖凝胶电泳等，具体可为2％琼脂糖凝胶电泳。

所述多重PCR的反应条件具体可为：95℃、5min；94℃、30s，52℃、60s，72℃、90s，35个循环；72℃、10min。所述多重PCR的反应体系中，反应初始时，每个所述引物对的上游引物和下游引物的浓度具体均可为0.1mmol/L。